蛋白磷酸化是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的初級載體之一，也是癌癥研究和藥物研發(fā)的一個主要研究領(lǐng)域。激酶是一種催化蛋白磷酸化的酶類，激酶抑制類藥物是癌癥靶向治療的主要類型之一，一系列研究小組都在探索利用磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析來幫助選擇合適的治療方法，以及追蹤患者對于治療的應(yīng)答反應(yīng)。

例如，美國安德森腫瘤中心的研究人員Gordon Mills使用反向蛋白芯片分析了上千名患者的癌癥信號通路，希望鑒定出患者的亞型和治療方法。喬治梅森大學(xué)應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)和分子醫(yī)學(xué)中心Emanuel Petricoin同樣也采用了RPPA法分析腫瘤信號，并指導(dǎo)患者治療。最初由乳腺癌慈善團(tuán)體Side-Out Foundation發(fā)現(xiàn)的結(jié)果表明，使用磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)指導(dǎo)患者治療可以延長轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的無進(jìn)展生存期。

隨著質(zhì)譜檢測靈敏度的不斷提高，這些方法可以用于腫瘤信號分析。紀(jì)念斯隆凱特靈癌癥中心的研究人員近期發(fā)表了一種質(zhì)譜方法，他們計劃在接下來的臨床試驗中使用該方法檢測癌癥信號活性，最終指導(dǎo)癌癥治療。

然而，這些工作都只關(guān)注于腫瘤組織的分析。這就給我們帶來了一些挑戰(zhàn)，因為有些患者的腫瘤組織無法獲取并用于活檢，即使有些情況下能夠進(jìn)行取樣活檢，這種取樣也無法頻繁進(jìn)行。

在基因組學(xué)中，這些限制因素促使研究人員和公司開始尋找液體活檢方法，其中包括分析由腫瘤流入血液中的ctDNA。但采取相同的方法進(jìn)行血液磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析并不容易實現(xiàn)，因為血液中這類分子的濃度非常低，而且血液中的磷酸化蛋白質(zhì)通常會在循環(huán)磷酸酶作用下快速去磷酸化。

大部分磷酸化蛋白并不會第一時間進(jìn)入血液中。即使磷酸化蛋白由腫瘤釋放，它們也會立即去磷酸化，因為磷酸酶非常活躍而且含量豐富。人們之前嘗試?yán)醚汉湍蛞簶颖具M(jìn)行磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析，但這些分析出現(xiàn)的時間很短。

為了擺脫這種限制，Tymora Analytical Operations公司總裁及CTO Anton Iliuk和同事們在循環(huán)細(xì)胞外膜泡（EVs）中分析這種磷酸化蛋白質(zhì)，例如微泡和外泌體，這兩者都含有來自起源細(xì)胞的遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)。目前，很多研究人員都在嘗試將外泌體作為潛在的臨床樣本，如診斷公司Exosome Diagnostics和NX Prenatal則對外泌體相結(jié)合的RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行測定，對前列腺炎和早產(chǎn)等情況進(jìn)行檢測評估。

Iliuk團(tuán)隊今年年初在PNAS上發(fā)表文章，他們在30個乳腺癌患者和6名健康對照個體中進(jìn)行血漿細(xì)胞外膜泡檢測，結(jié)果鑒定出144個蛋白質(zhì)在癌癥患者體內(nèi)會出現(xiàn)高度磷酸化。研究人員利用Thermo Fisher Q Exactive HF儀器對其中四種蛋白質(zhì)進(jìn)行靶向質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)其中三個蛋白質(zhì)（RALGAPA2、PKG1、TJP2）在乳腺癌患者中的磷酸化水平更高。

來源：Tymora公司官網(wǎng)

研究中引用Tymora公司發(fā)明的磷酸化蛋白富集方法——PolyMAC，利用攜帶金屬離子的可溶性納米高分子在復(fù)雜的復(fù)合物中捕獲磷酸蛋白。另一方面，研究人員是使用超速離心法收集細(xì)胞外膜泡，然而這種方法不易重復(fù)，而且細(xì)胞外膜泡復(fù)原率很低。因此，團(tuán)隊開發(fā)了一種基于微流體的方法，通過使用一種微流體墨盒來捕獲細(xì)胞外膜泡。在使用少量電壓進(jìn)行靶分子的原位提取后就進(jìn)行捕獲，這種方法讓研究人員能夠獲得體內(nèi)的磷酸化蛋白，且在這個過程中不會使其降解，進(jìn)一步優(yōu)化了靶向細(xì)胞外膜泡捕獲方法和體內(nèi)磷酸化蛋白質(zhì)提取方法。

近日，普渡大學(xué)和Tymora Analytical Operations公司的研究人員開發(fā)了一種用于血液或尿液磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法，將微流控型微泡和外泌體捕獲法與Tymora的磷蛋白富集試劑相結(jié)合，通過血液或尿液樣本分析腫瘤信號通路，這與利用ctDNA分析進(jìn)行液態(tài)活檢的方法類似。他們希望利用該方法檢測并處理各種不同的癌癥。

雖然這項工作仍然處于早期階段，Iliuk期望將這種方法作為循環(huán)腫瘤細(xì)胞和ctDNA分析之外的另一種液態(tài)活檢方法。采用這種方法不需要采集活體組織或有腫瘤出現(xiàn)就可以進(jìn)行液體活檢，能夠持續(xù)性監(jiān)控疾病，而不是等到有可獲取的活體組織時才開始檢測。

目前，Tymora公司正在尋求腫瘤研究領(lǐng)域的商業(yè)合作伙伴，希望進(jìn)一步探索某些癌癥的研究方法。該公司同時還在開展一項內(nèi)部項目，利用尿液中細(xì)胞外膜泡的磷酸化蛋白組學(xué)分析監(jiān)控膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)率。研究人員已經(jīng)在膀胱癌患者和健康人群間發(fā)現(xiàn)了大量磷酸化差異，因此，他們正在嘗試開發(fā)檢測試劑盒進(jìn)入診斷領(lǐng)域。

此外，Tymora公司還致力于將其微流體式細(xì)胞外膜泡捕獲和提取平臺商業(yè)化，作為其他研究人員研究細(xì)胞外膜泡時的一個工具。