當前單細胞水平的研究越來越受到重視,已廣泛應用于單細胞的PCR擴增、基因組測序和組織工程研究等領域。隨著腫瘤干細胞研究的不斷深入,單個腫瘤干細胞的有效分離和培養成為腫瘤干細胞發生的分子機制、侵襲和轉移、腫瘤干細胞的靶向治療以及與微環 境的相互作用等研究中需要迫切解決的難題之一。 因此,我們擬建立一套簡捷高效的腫瘤干細胞的單細胞分離技術和培養技術,為相關研究提供技術支持。

目前,單細胞分離方法有4種:

(1)手工機械分離 法:在倒置顯微鏡下直接分離細胞,但易損傷細胞;

(2) 熒光流式細胞技術分離法:熒光激活流式細胞分離技術能夠有效獲得單個細胞,但是對流式細胞儀的性能要求較高,儀器價格高昂;

(3)激光顯微切割技術:能夠從組織中分離單個細胞,但不適用于細胞培養與擴增,且需要操作者極其熟練地掌握切割技術;

(4)顯微操控儀: 采用顯微操控技術從單細胞懸液中吸取單個細胞,但精細的操作以及貴重的儀器使研究者望而卻步。以上技 術的缺陷使之無法得到推廣應用,于是有研究人員自行 改良了操作方法,如使用小號靜脈注射針及微量移液器 組合進行單細胞分離[11],但是由于腫瘤干細胞粘附性 強,分離時易損傷,效果依然欠佳。因此,我們通過實驗 摸索和總結,建立了一套有效防止腫瘤干細胞損傷的簡 易單細胞分離技術,并可高效擴增單個腫瘤干細胞。

單個腫瘤干細胞分離及其培養材料

DMEM/F12培養基（Gibco）、Accutase 酶(eBioscience);B27 添加劑,重組人表皮生長因子 (EGF)、重組人堿性成纖維生長因子(bFGF)均購自Invitrogen;白血病抑制因子(LIF)(Millpore);BJ-40 毛細玻璃管(北京正天易公司);人結腸癌 SW480 細胞系 來自 ATCC(美國組織培養保藏中心),由上海生物細胞 所提供。人結直腸癌干細胞 SW480-17 細胞由本課題組自行篩選凍存。

單個腫瘤干細胞分離及其培養實驗方法

①配制培養基

無血清培養基由DMEM/F12、B27、 EGF(20 ng/ml)、bFGF(10 ng/ml)、LIF(10 ng/ml)組成。 1.2.2 制備單細胞分離裝置 BJ-40 毛細玻璃管(外徑 1.0 mm,內徑 0.8 mm)置于 1 mol/L 鹽酸中浸泡 24 h,然 后用超純水連續沖洗,65 °C烘干,高壓滅菌備用。取出 細玻璃管在酒精燈外焰燒烤數秒,迅速拉成細絲狀制成 口吸管。取無菌塑料管 1 段(30~40 cm),兩端分別連接 滅菌的 10 μl 和 100 μl 吸頭,10 μl 吸頭連接口吸管,建立 口控毛細管單細胞分離裝置。

種植單細胞 SW480 用胰酶消化后制成單細胞懸 液備用。應用自制的口控毛細管單細胞分離裝置于顯 微鏡下吸取單細胞懸液然后種植于 96 孔板中,每孔中 加入 1 個細胞。

②免疫熒光檢測

取單個 SW480 細胞無血清培養 30 d 后的克隆球,4%多聚甲醛固定 20~30 min,PBS 洗 滌,0.2% Triton X-100,室溫孵育 10 min,PBS 洗滌, 10%正常羊血清,封閉 30 min,吸取羊血清,CD133、 CK7 抗體標記過夜,PBS 洗滌,熒光標記二抗(FITC、 TRITC),室溫閉光孵育 1 h,PBS 洗滌,再在每皿內加 5 μg/ml DAPI 染液核襯染 5 min,PBS 洗滌后熒光顯微鏡下觀察。

③兩種結直腸癌干細胞培養方式比較

挑選單個腫瘤干細胞克隆球消化后制成單細胞懸液備用。取 Corning 35 mm × 10 mm 的皿,加入 10 滴培養基,每滴 20 μl,再加入 2 ml 石蠟油,建立微滴培養池。應用自制 的口控毛細管單細胞分離裝置于顯微鏡下吸取單細胞懸液然后在每個液滴用口吹出一個細胞,種植于石蠟油封閉的微滴培養基中。同樣方式吸出細胞分別種植于 96 孔板中,每孔中加入 1 個細胞。倒置顯微鏡下觀察細 胞生長30d。

④統計學方法

采用 SPSS13.0 軟件處理,計數資料 采用χ2檢驗,P<0.05 表示差異具有統計學意義。

單個腫瘤干細胞分離及其培養實驗結果

無血清培養環境下單個 SW480 細胞在 96 孔板中的克隆形成率為 1.04%(2/192)免疫熒光顯示克隆球中 CD133 高表達,CK7 幾乎不表達而在血清培養環境下 則 相 反( 圖 1 )。

采用口控毛細管單細胞分離裝置(圖 2)共種植了 199 個微滴,微滴中單細胞的數量為 197 個,單細胞分 離的有效率為 98.99%(197/199),未成功的兩個微滴均為 2 個細胞;另種植了2塊96孔板共192個孔,其中 單細胞的數量為 184,單細胞分離的有效率為 95.8%(184/192)。

兩種培養方式觀察比較(圖 3、4),第 1 次分裂發生的時間都集中在第 3 天,分裂的概率分別為:微滴培養 24.9%(49/197),96 孔板培養 20.1%(37/184),兩者無明 顯差別(P>0.05)。微滴培養第 2 次分裂的時間集中在 第 6 天,分裂概率為 20.3%(40/197),而在 96 孔板培養第 2 次分裂集中在第 5 天,分裂概率為 16.8%(31/184),兩 者同樣無明顯差異(P>0.05)。此后微滴中細胞分裂的 時間長于 96 孔板內培養的細胞。11.5%(22/197)的單 細胞在微滴中能夠持續擴增 30 d;9.2%(17/184)的單細 胞能夠在 96 孔板中能夠持續擴增 30 d,兩種培養方式 在維持單細胞持續擴增上無明顯差別(P>0.05,圖 5)。

口控毛細管的單細胞分離裝置最初用于卵細胞移植,我們在此基礎上簡化改造,建立口控毛細管腫瘤 干細胞單細胞分離裝置。該裝置材料容易獲得,不需要 專用設備。毛細玻管在輕烤后管口變得圓滑,口吸操作 力度輕柔可控,能夠有效降低分離吸取單細胞時所造成 的機械損傷。采用口控毛細管單細胞分裂裝置分離出 來的單個 SW480 細胞能在無血清的培養環境中形成克 隆球,克隆形成率約為 1.04%,并且克隆球中 CD133 的 表達高而 CK7 的表達低,進一步驗證為結直腸癌干細胞。此種方法分離單個腫瘤干細胞以口控毛細管單細 胞分離裝置為依托,以無血清培養方式篩選腫瘤干細 胞,操作靈活、簡單快捷、便于推廣,不僅可以分離腫瘤干細胞,而且可用于從混合類型的細胞中挑取單一類型 細胞,具有很好的實用價值。

在單細胞培養技術中,我們選用了微滴培養法。微滴培養法最先由 Brinster 建立,應用于卵細胞培養和胚胎發育研究。2010 年 Araki 等觀察研究了小鼠精 原干細胞在微滴中的培養,發現小鼠的精原干細胞同樣 可以在微滴中發生擴增,而且此方法也可以用來培養其 他干細胞。

圖3 動態觀察微滴中培養的單個腫瘤干細胞

圖4 動態觀察96孔板培養的單個腫瘤干細胞

我們將結直腸癌干細胞作為研究對象,分別接種于微滴和 96 孔板。與傳統的 96 孔板培養相比,結直腸癌 干細胞在微滴及 96 孔板中均可獲得分裂增生,兩者在 分裂時間以及可持續分裂的細胞數量上無顯著差異。

但是微滴培養法在操作靈活性及觀察便捷性方面具有明顯優勢:

(1)微滴培養技術可以全方位立體動態觀察 目的細胞整個培養過程,并能在分裂的早期階段再次分 離單個細胞,操作簡便快捷,為腫瘤干細胞、腫瘤祖細 胞、移行擴增細胞和成熟腫瘤細胞生物學的動態演變規 律和分子機制研究提供了實驗技術基礎;

(2)石蠟油液 封的培養微滴可以減少培養基的流失,保持微滴中的 溫度、pH 值的穩定,特別是某些珍貴而稀少的培養基,能夠充分顯現微滴培養的優勢,而 96 孔板長時間培養時,培養液易蒸發而改變培養基內環境,影響細胞生長; 

(3)因微滴置于培養皿中,能多角度靈活操作,而傳統的 96 孔板孔徑比較狹長,種植細胞時候有一定的難度和局 限。綜上所述,石蠟油封閉微滴培養法培養單個腫瘤干 細胞有其獨特的優勢,可以做為培養單個腫瘤干細胞的首選。

圖5 兩種培養方式比較

因此,我們根據腫瘤干細胞的特性,建立了一套高效可靠的單個腫瘤干細胞的分離和培養方法,該方法操作簡單、成功率高,便于推廣,可用于腫瘤干細胞的單細 胞研究。石蠟油封閉微滴培養法培養單個腫瘤干細胞有 其獨特的優勢,可以作為培養單個腫瘤干細胞的首選。