微流控芯片技術(shù)在細(xì)胞裂解、計數(shù)、凋亡檢測、遷移、單細(xì)胞捕獲、細(xì)胞間作用的研究與應(yīng)用
20世紀(jì)90年代以來,微流控芯片技術(shù)得到了快速發(fā)展。由于具有小型化、集成化、高通量、低消耗、分析快速等特點(diǎn),微流控芯片作為一種新型的生物學(xué)研究平臺,能夠提供傳統(tǒng)方法不具備的精細(xì)和可控制的細(xì)胞研究條件,在細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域中得到了廣泛關(guān)注。本文介紹其在細(xì)胞裂解、計數(shù)、凋亡檢測、遷移、單細(xì)胞捕獲、細(xì)胞間作用等方面的研究進(jìn)展。
1.細(xì)胞裂解
細(xì)胞裂解是對細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)(核酸、蛋白質(zhì)、信號小分子等)進(jìn)行分析的關(guān)鍵步驟。根據(jù)細(xì)胞破裂的原理可將細(xì)胞裂解方式分為以下幾種:物理裂解、化學(xué)裂解、電裂解。物理方法主要指采用冷凍、滲透壓、剪切力和超聲波等破碎細(xì)胞?；瘜W(xué)方法則指用酶或表面活性劑處理細(xì)胞膜,從而使細(xì)胞裂解。電裂解法是使用電脈沖或連續(xù)的直流電,將細(xì)胞破碎。
化學(xué)裂解中常用的使細(xì)胞膜變性的試劑有TritonX-100、鹽酸胍、蛋白酶和十二烷基磺酸鈉(SDS)。圖3A為采用化學(xué)試劑進(jìn)行細(xì)胞裂解的芯片,在a-c口分別加入磷酸鹽緩沖液(PBS)和裂解液SDS、TritonX-100,在d口加入胎牛血清,繼而引入要裂解的細(xì)胞,細(xì)胞在圖中通道交叉處裂解,細(xì)胞裂解物在下游被檢測。但化學(xué)裂解法會將細(xì)胞器膜一起破壞,不適用于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析,除此之外還需要對細(xì)胞裂解物進(jìn)行分離純化,操作相對麻煩,裂解試劑的使用還可能干擾下游對目標(biāo)物質(zhì)的檢測。
細(xì)胞膜的雙層結(jié)構(gòu)是絕緣的,但暴露在電場中的細(xì)胞會產(chǎn)生一個跨膜電勢,當(dāng)跨膜電勢超過大約1V時細(xì)胞便會發(fā)生裂解。Lu等在芯片上設(shè)計了鋸齒狀電極,并使用交流電對細(xì)胞進(jìn)行裂解,通過控制電壓大小及頻率,使細(xì)胞膜破裂而細(xì)胞器膜保持完整,為在亞細(xì)胞水平進(jìn)行分析提供了可能。細(xì)胞膜一般需要在較高外加電場強(qiáng)度下(約1000V/cm左右),才能獲得大約1V的跨膜電勢而發(fā)生裂解。由于細(xì)胞進(jìn)樣需要在較低電場強(qiáng)度條件下,Lee等通過改變微流控芯片通道的寬度解決了這一問題,如圖3B所示,他們將細(xì)胞裂解區(qū)通道寬度較其它區(qū)域縮小20倍,則該區(qū)域的電場強(qiáng)度則達(dá)到其它區(qū)域的20倍,從而實現(xiàn)了細(xì)胞的低場強(qiáng)進(jìn)樣,高場強(qiáng)裂解。一般的細(xì)胞電裂解使用的都是二維電極,對細(xì)胞膜產(chǎn)生不均一的力作用,有人采用了高50μm、直徑50μm的三維柱形電極對白細(xì)胞進(jìn)行裂解,可以極大地提高裂解效率。細(xì)胞電裂解可在短時間達(dá)到裂解效果,最快可達(dá)33ms,比SDS裂解的速度快8倍。
圖3細(xì)胞裂解裝置示意圖
A:微流控芯片裂解和孵育HL-60細(xì)胞示意圖,裂解液和作用物從a-c口注入,細(xì)胞從d口注入,熒光探測器和顯微鏡位于下游交叉處;B:采用低直流電壓連續(xù)裂解細(xì)胞裝置,微通道寬度為200μm,裂解處孔的寬度為10μm;C:無線感應(yīng)生熱裂解細(xì)胞芯片示意圖,將邊長6mm的六邊形金屬片整合到兩層PDMS中間,整個裝置包括一個入口(1),三個小室(2-4),一個出口(5),加熱元件(6)和感應(yīng)線圈(7)。
電裂解在高效快速的同時也存在一些弊端,如電極壽命短、操作過程復(fù)雜、需要外加電源。為克服這些缺點(diǎn),Baek等設(shè)計了一種無線感應(yīng)生熱裂解細(xì)胞的裝置,如圖3C所示,芯片底部放置一個直徑6mm粗的感應(yīng)線圈,兩層PDMS中間有厚度為100μm的六邊形金屬薄片,感應(yīng)線圈通電后,通過電磁感應(yīng)現(xiàn)象,金屬薄片發(fā)熱,進(jìn)而將上層芯片小室中的細(xì)胞裂解。
培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好,因此要進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。細(xì)胞計數(shù)通常與細(xì)胞分選、裂解等功能一起整合到微流控芯片上。對細(xì)胞計數(shù),常使用的方法有熒光檢測、數(shù)字圖像處理技術(shù)(CCD圖像傳感器)和阻抗測量。前兩種方法主要是將流式細(xì)胞儀與微流控芯片結(jié)合起來,細(xì)胞用特殊熒光素標(biāo)記,受激發(fā)后產(chǎn)生熒光,經(jīng)光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換成電信號計數(shù)細(xì)胞。利用阻抗測量的方法也可以在芯片上實現(xiàn)對血細(xì)胞的計數(shù),當(dāng)細(xì)胞流經(jīng)檢測區(qū)域時,溶液電導(dǎo)率、電容、電阻發(fā)生變化,產(chǎn)生脈沖信號,脈沖信號的多少即反應(yīng)了細(xì)胞數(shù)量的多少。除此之外,還可在芯片上嵌入一對光纖維,當(dāng)細(xì)胞流經(jīng)兩纖維之間時,光被擋住,這一信號被捕捉并轉(zhuǎn)化成電信號,對流過的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。CD4+T淋巴細(xì)胞的計數(shù)在HIV陽性患者的檢測中起著重要的作用,目前,利用上述方法已經(jīng)成功實現(xiàn)了在微流控芯片上對CD4+T淋巴細(xì)胞的計數(shù),但檢測前需在通道中注入單克隆抗體以捕捉T細(xì)胞。Imaad等[58]還設(shè)計了一種新穎的裝置來實現(xiàn)細(xì)胞的計數(shù),如圖4所示,他們將PDMS與光碟(compactdisc,CD)整合在一起,將二進(jìn)制數(shù)據(jù)寫到光盤上,用相應(yīng)的輸出數(shù)據(jù)組成音頻文件,將音頻文件刻錄到可錄光碟中,當(dāng)有細(xì)胞出現(xiàn)時便會采集到錯誤數(shù)據(jù),以此來實現(xiàn)細(xì)胞計數(shù)。
圖4微流控芯片細(xì)胞計數(shù)研究
裝置包括5層:PDMS層、聚碳酸酯薄層、光敏染料層、金屬反射層和塑料保護(hù)層。
3.細(xì)胞凋亡
細(xì)胞凋亡是一種特殊的細(xì)胞程序性或自殺性死亡,通過消除體內(nèi)不需要的細(xì)胞來維持組織穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。增強(qiáng)或抑制細(xì)胞凋亡可導(dǎo)致發(fā)育缺陷、自身免疫缺陷病和神經(jīng)退行性病變。細(xì)胞凋亡除了在胚胎和大腦發(fā)育過程起調(diào)節(jié)作用外,還與很多疾病有關(guān),包括心臟病和癌癥。伴隨著細(xì)胞凋亡過程,細(xì)胞形態(tài)和功能會發(fā)生變化,如細(xì)胞皺縮、核質(zhì)濃縮、線粒體外膜跨膜電勢消失、通透性改變、釋放細(xì)胞色素C到胞漿、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)激活、細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸外翻,最終形成凋亡小體。
細(xì)胞凋亡過程中DNA會形成長度為50~300Kb的片段[65],依據(jù)這一特征Klepárník等設(shè)計了一款芯片用于檢測多柔比星(doxorubicin)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的凋亡,細(xì)胞在堿性環(huán)境下裂解,用溴化乙錠標(biāo)記DNA,電泳分離后在共聚焦顯微鏡下觀察DNA片段長度,以此來判斷細(xì)胞凋亡的程度。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)是一類在天冬氨酸殘基處裂解蛋白質(zhì)的蛋白酶家族,在細(xì)胞凋亡過程中起調(diào)節(jié)作用。Randall等在微流控芯片上實現(xiàn)了同時捕獲并誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡,他們將抗CD-95的抗體粘附在玻璃基底上,連有脂肪酸合成酶(Fas)受體的細(xì)胞流經(jīng)微流控芯片通道時被捕獲,與此同時經(jīng)由caspases-8途徑誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡,被固定在通道表面的細(xì)胞被認(rèn)為經(jīng)歷細(xì)胞凋亡過程。Dai等設(shè)計了濃度梯度的芯片檢測細(xì)胞凋亡程度,將青色和黃色熒光蛋白用含有caspase-3裂解位點(diǎn)的短肽連接,通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa-C3細(xì)胞,然后用不同濃度的依托泊苷(一種治療腫瘤的藥物)處理細(xì)胞,凋亡的細(xì)胞激活caspase-3,在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光,而未凋亡細(xì)胞可觀察到藍(lán)色熒光。除此之外,細(xì)胞凋亡時細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸外翻,鈣磷脂結(jié)合蛋白V(AnnexinV)與磷脂酰絲氨酸有高度的親和力,利用這一特性,Zhao等以AnnexinV功能化的量子點(diǎn)為探針,在微流控芯片上檢測經(jīng)抗癌藥物作用后白血病HL-60細(xì)胞的凋亡程度,熒光強(qiáng)度反映了細(xì)胞凋亡的程度,在單細(xì)胞水平上成功區(qū)分了凋亡和非凋亡細(xì)胞。
圖5微流控芯片細(xì)胞遷移研究
A:左圖為單個HeLa細(xì)胞通過微缺口的遷移研究,這個裝置包括3個平行的通道和兩排寬度為3μm和10μm的微缺口,右圖箭頭指示細(xì)胞核的位置,HeLa細(xì)胞從底部通道向中間通道遷移;B:匯合細(xì)胞創(chuàng)造邊緣傷口過程,首先從三個入口灌入細(xì)胞,兩天后當(dāng)細(xì)胞匯合到一起時,分別灌注30mLPBS、胰蛋白酶和EDTA混合液,然后再加入表皮生長因子、細(xì)胞松弛素D和鬼比環(huán)肽;C:用于研究細(xì)胞遷移的開放性微流控裝置。1:從底部觀察到的芯片示意圖。PDMS層包括細(xì)胞存儲池和微通道,含有cAMP和葉酸混合液的微滴管放在微通道的前方;2:裝置側(cè)面觀,細(xì)胞從儲液池灌入,在玻璃層表面向微滴管方向移動;3:窄通道區(qū)域內(nèi)細(xì)胞遷移示意圖。區(qū)域內(nèi)總共有16個通道,寬度分別為6,8,10,12μm,每隔寬度重復(fù)4次;4:兩個寬通道區(qū)域內(nèi)細(xì)胞遷移示意圖,每個通道寬度為100μm
4.細(xì)胞遷移
細(xì)胞遷移也稱細(xì)胞運(yùn)動,指的是細(xì)胞在接收到遷移信號或感受到某些物質(zhì)的濃度梯度后產(chǎn)生的移動。細(xì)胞覓食、損傷的痊愈、胚胎發(fā)生、免疫、感染和癌癥轉(zhuǎn)移等生理現(xiàn)象都涉及到細(xì)胞的遷移,因此細(xì)胞遷移是目前細(xì)胞生物學(xué)研究的一個重要內(nèi)容。目前,最常用的研究細(xì)胞遷移的方法之一是劃痕法,Liang等設(shè)計了一種填充芯片來研究細(xì)胞的遷移,芯片由兩層管道組成,下層用來培養(yǎng)細(xì)胞,上層管道用來控制液體流動及產(chǎn)生傷痕區(qū)域,每隔一段時間拍攝圖像并計算出沒有被細(xì)胞填充的區(qū)域,借此衡量細(xì)胞的遷移速度。Chaw等設(shè)計了如圖4A所示的芯片來研究細(xì)胞的遷移,芯片共有三個平行的通道,中間通道與另兩個通道間分別有多個寬3μm和10μm的缺口,其中上下兩個通道灌入細(xì)胞和基本培養(yǎng)基,而中間通道灌入基本培養(yǎng)基和10%的胎牛血清,在趨化因子的作用下,上下兩層通道中的細(xì)胞會按箭頭指示方向運(yùn)動。Nie等用胰蛋白酶消化產(chǎn)生劃痕,觀察細(xì)胞在表皮生長因子等作用下的遷移情況,實驗過程如圖4B所示,首先在三個并行的寬300μm通道灌注胚胎纖維細(xì)胞(NIH3T3),待細(xì)胞貼壁生長后用胰蛋白酶和EDTA混合液(TE)消化,然后加入基本培養(yǎng)基(DMEM)、表皮生長因子(EGF)、細(xì)胞松弛素D(CD)、鬼比環(huán)肽(phalloidin),觀察細(xì)胞遷移運(yùn)動。Jowhar等還設(shè)計了不同寬度的通道來觀察盤基網(wǎng)柄菌(Dictyosteliumdiscoideum)的遷移活動,通常情況下盤基網(wǎng)柄菌以單細(xì)胞形式存在,當(dāng)食物匱乏時分泌環(huán)腺苷酸(cAMP)并在cAMP作用下聚集成多細(xì)胞,如圖所示,將饑餓處理的極性細(xì)胞和未處理的非極性細(xì)胞分別用熒光標(biāo)記,混合后引入到細(xì)胞儲液池,在通道另一側(cè)用微滴灌注入cAMP和葉酸混合液,觀察兩種細(xì)胞的遷移速率和遷移路徑。
圖6單細(xì)胞捕獲示意圖
A:左圖為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽介導(dǎo)的細(xì)胞硫醇化過程。兩端均含有巰基的九肽與CHO細(xì)胞表面結(jié)合,然后巰基官能團(tuán)與金電極表面結(jié)合,捕獲細(xì)胞。右圖為整體單細(xì)胞捕獲芯片示意圖,當(dāng)電場強(qiáng)度為50V/cm時,細(xì)胞被捕獲在相應(yīng)的交錯電極;B:用于細(xì)胞捕獲的蛇形通道結(jié)構(gòu)示意圖。細(xì)胞懸液從進(jìn)口注入,單個細(xì)胞相繼被捕獲在捕獲口袋,主通道寬50μm,捕獲口袋直徑20μm。
5.單細(xì)胞捕獲
在傳統(tǒng)的對細(xì)胞增殖、分化及細(xì)胞對外界刺激反應(yīng)的研究中,通常把細(xì)胞樣品看成是均一穩(wěn)定的,而事實上細(xì)胞通常是異質(zhì)性的,所以單細(xì)胞分析在理解細(xì)胞個體間的差異顯得尤為重要。在單細(xì)胞水平進(jìn)行研究相對于傳統(tǒng)的細(xì)胞生物技術(shù)及分析方法更具優(yōu)勢,因為其能更精確、直接地觀察到細(xì)胞、亞細(xì)胞水平的動態(tài)和不連續(xù)過程,使蛋白質(zhì)定位及動力學(xué)的研究成為可能,同時可以檢測單個細(xì)胞對相同的信號分子的不同反應(yīng)。單細(xì)胞水平研究的前提是實現(xiàn)單細(xì)胞捕獲,進(jìn)而才能對其內(nèi)含物進(jìn)行分析或?qū)崿F(xiàn)單細(xì)胞操控。目前,已經(jīng)有很多成功應(yīng)用的實例,比如Nicholas等設(shè)計了電場驅(qū)動單細(xì)胞捕獲的裝置,如圖5A所示,中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHOcells)用合成的含有巰基的九肽(CCRRGDWLC)進(jìn)行標(biāo)記,然后將細(xì)胞懸浮液引入到微通道中,被標(biāo)記的細(xì)胞與金電極表面結(jié)合形成金硫鍵,從而達(dá)到細(xì)胞捕獲的效果。Takahiro等設(shè)計了捕獲口袋來實現(xiàn)單細(xì)胞捕獲,如圖5B所示,蛇形通道兩側(cè)有直徑20μm的捕獲口袋,當(dāng)細(xì)胞懸浮液流經(jīng)通道主通道時,會有部分細(xì)胞被捕獲,進(jìn)而進(jìn)行熒光標(biāo)記、細(xì)胞裂解及內(nèi)含物的檢測。就目前看來,微流控芯片上進(jìn)行單細(xì)胞操作有著非常好的應(yīng)用前景,比如對神經(jīng)細(xì)胞之間遞質(zhì)的傳遞,體外受精以及細(xì)胞之間相互作用的研究等。
圖7細(xì)胞間相互作用研究示意圖
A:NIH3T3與HepG2共培養(yǎng)示意圖,上下兩個通道用于灌注細(xì)胞,左邊通道用于培養(yǎng)基的注入,右側(cè)通道用于代謝廢物的流出;B:巨噬細(xì)胞和成骨細(xì)胞共培養(yǎng)示意圖,巨噬細(xì)胞位于上游培養(yǎng)區(qū),成骨細(xì)胞位于下游培養(yǎng)區(qū);C:T細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用研究示意圖,首先將HUVECs灌注到芯片上,并用腫瘤壞死因子(TNF-α)刺激誘導(dǎo)表面分子表達(dá),T細(xì)胞用異硫氰酸熒光素(FITC)連接的CD3抗體標(biāo)記,在熒光顯微鏡下觀察T細(xì)胞,SLE:系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
細(xì)胞間相互作用是指細(xì)胞間的直接作用,在多細(xì)胞生物的發(fā)育及功能發(fā)揮中起著重要作用,并且在衰老及病理條件下可以維持體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)。細(xì)胞間相互作用參與許多生理及病理過程,例如胚胎發(fā)育、傷口愈合、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等。微流控芯片具有設(shè)計靈活的特點(diǎn),在大量的微通道中可同時培養(yǎng)多種細(xì)胞,通過對3D胞外基質(zhì)的引入可實時監(jiān)測和控制生化因子和信號分子的產(chǎn)生及其濃度,更適合細(xì)胞間相互作用的研究。目前微流控芯片研究細(xì)胞間相互作用最常用的方法是細(xì)胞共培養(yǎng)。Liu等用芯片實現(xiàn)胚胎成纖維細(xì)胞(NIH3T3)和肝癌細(xì)胞(HepG2)的共培養(yǎng),如圖7A所示,兩種細(xì)胞分別用不同的熒光分子標(biāo)記,打開通道閥門,給予充足的營養(yǎng),在熒光顯微鏡下可觀察到NIH3T3向HepG2方向移動。Wei等設(shè)計了一種能更精確反映細(xì)胞間相互作用的微流控細(xì)胞共培養(yǎng)體系,如圖7B所示,體系包括上游和下游細(xì)胞培養(yǎng)區(qū),上游細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)用來培養(yǎng)巨噬細(xì)胞,當(dāng)用脂多糖(LPS)或聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)給予刺激時,巨噬細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-1β和腫瘤壞死因子-α,這兩種代謝產(chǎn)物通過微通道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成濃度梯度,作用于下游的成骨細(xì)胞,促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌前列腺素E2。白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用對白細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中的遷移及功能發(fā)揮起著重要作用,而這兩種細(xì)胞的相互作用需要細(xì)胞粘附分子(CAM)的參與,為了研究這兩種細(xì)胞間的作用,Park等設(shè)計如圖7C所示芯片,通過CAM的表達(dá)量來研究T淋巴細(xì)胞(白細(xì)胞的一種)與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)之間的相互作用。
微流控芯片技術(shù)自20世紀(jì)90年代出現(xiàn)以后,隨著生物、材料、化學(xué)、物理工程和電子工程等學(xué)科的介入,目前已取得了巨大的發(fā)展,其最終目的是建立多功能芯片實驗室。微流控芯片技術(shù)正以其獨(dú)特的優(yōu)勢越來越多地應(yīng)用到細(xì)胞生物學(xué)研究中,其不僅可以為細(xì)胞提供可控制的生存微環(huán)境,與其他分析方法結(jié)合檢測細(xì)胞內(nèi)生化過程,而且在細(xì)胞個體、細(xì)胞群體和多細(xì)胞生命體三個層次對細(xì)胞的生命活動進(jìn)行深入研究。另一方面,微流控芯片仍處于發(fā)展初期,許多方面的技術(shù)還不成熟,如不能進(jìn)行長期細(xì)胞培養(yǎng);細(xì)胞三維培養(yǎng)中一些水凝膠和粘連蛋白的引入可能阻塞通道和妨礙物質(zhì)傳輸;電裂解細(xì)胞時產(chǎn)生的焦耳熱和氣泡會影響細(xì)胞生長和代謝等。目前微流控芯片大多處于實驗室概念化論證階段,尚未達(dá)到理想的商業(yè)化和通用化程度;對微流控芯片技術(shù)了解不多的生物研究人員,應(yīng)用起來還有一定的困難。但是,基于微流控芯片的突出優(yōu)點(diǎn)和人們對新技術(shù)的需求,我們相信微流控芯片細(xì)胞實驗室將成為細(xì)胞生物學(xué)研究的重要平臺。
（文章節(jié)選自：微流控芯片技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)展作者：姚琳 白亮 吳亮其 丁永勝*轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請聯(lián)系刪除）
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