基于微流控液滴的單細胞測序方法因其極高的通量和單細胞的靈敏度而引發(fā)了生物學(xué)的一次革命。在微流控單細胞測序技術(shù)中，DNA編碼微球是其核心。目前常見的用于高通量單細胞測序的DNA編碼微球分別為在inDrop技術(shù)、Drop-seq技術(shù)和10X Genomics公司測序技術(shù)中使用的微球。這些微球各有其優(yōu)缺點：inDrop技術(shù)中的條形碼微球由于能夠緊密堆積從而能夠在液滴中高效負載，但其合成所需的引物價格昂貴且需要引入對細胞和核酸有影響的紫外光；Drop-seq技術(shù)中的條形碼微球因反應(yīng)過程集中在微球表面而降低總體反應(yīng)效率；10X Genomics公司測序技術(shù)中的DNA編碼微球價格昂貴且DNA編碼引物不能靈活調(diào)節(jié)。因此，如何發(fā)展一種新的易制備、易操作、造價低、效率高的DNA編碼微球是高通量單細胞測序技術(shù)開發(fā)中的一個難題。

David Weitz教授課題組報道了一種可控降解的聚丙烯酰胺條形碼微球的制備方法。該微球能夠在DTT（二硫蘇糖醇，一種與多數(shù)生物化學(xué)體系兼容的常見的還原劑）存在下快速發(fā)生降解，并將微球上的DNA釋放到液滴中。該可控降解型聚丙烯酰胺凝膠條形碼微球容易制備、容易降解、制作成本低、反應(yīng)效率高、條形碼設(shè)計靈活且能夠在液滴包裹中實現(xiàn)緊密堆積而提高液滴使用率。

圖1. (A) 可控降解型聚丙烯酰胺微球的合成和降解原理示意圖，(B)可控降解型微球在基于液滴的單細胞分析過程使用的圖示。

該團隊使用微流控設(shè)備首先制備了該可降解型聚丙烯酰胺凝膠微球，并探究了在DTT存在下的降解情況。實驗證明直徑為80 ?m左右的微球在1 mM DTT存在下能夠在3 min中完全降解，在10 mM DTT存在下能夠在30 s內(nèi)完全降解。聚丙烯酰胺凝膠微球降解后能夠?qū)⑽⑶蛏系囊镝尫诺饺芤褐惺蛊溆行У剡M行后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)，同時，降解后的產(chǎn)物并不會引起溶液物理性質(zhì)，如粘度等的變化。

圖2. (A) 微球在不同DTT濃度下的降解時間，(B)在1 mM DTT存在下0, 60, 120,以及180 s時微球在顯微鏡下的狀態(tài)，(C)在1 mM DTT存在下0, 60, 120,以及180 s時標(biāo)記上熒光后的微球的熒光圖像，(D)隨機選擇8個微球的熒光強度在降解過程中隨時間的變化情況。

在此基礎(chǔ)上，該團隊將可控降解型聚丙烯酰胺凝膠微球用于高通量液滴中單細胞的RNA和蛋白表達分析中。首先，將單個細胞和單個標(biāo)記上目標(biāo)基因引物序列的可降解型聚丙烯酰胺凝膠通過微流控技術(shù)包裹在單個液滴中，微球在DTT存在下降解后，將引物釋放到液滴里，去捕獲細胞裂解后的mRNA。以GAPDH和TCRA的mRNA為例，實驗結(jié)果證明，該方法能夠有效的捕獲細胞中的目標(biāo)mRNA，如下圖3所示。同時，若將編碼DNA和細胞表面蛋白的抗體偶聯(lián)并預(yù)先與細胞溫育，則該可降解型聚丙烯酰胺凝膠微球還可以應(yīng)用在單細胞的細胞表面蛋白，如CD3的表達分析中。在單細胞的RNA測序和蛋白表達分析中，可降解型聚丙烯酰胺凝膠微球不會對后續(xù)的生物化學(xué)反應(yīng)造成影響，能夠有效地實現(xiàn)其條形碼引物釋放的功能，并呈現(xiàn)出獨特的功能優(yōu)勢。同時，可降解型聚丙烯酰胺凝膠微球作為新的高通量單細胞測序分析中使用的工具，改善了傳統(tǒng)的條形碼微球的制備方案，能夠有效促進高通量單細胞測序技術(shù)的進一步發(fā)展。

圖3. (A)顯微鏡下包裹單個細胞和單個微球的液滴的產(chǎn)生過程，(B) TCRA和GAPDH mRNA的qPCR實驗結(jié)果，(C) GAPDH和TCRA mRNA在液滴中反應(yīng)后PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳實驗結(jié)果，(D)抗體–DNA偶聯(lián)物結(jié)合細胞表面蛋白的示意圖，(E)單細胞表面蛋白分析中的qPCR實驗結(jié)果，(F)細胞表面蛋白分析中的瓊脂糖凝膠電泳實驗結(jié)果。

以上相關(guān)實驗成果發(fā)表在Advanced Science雜志上（Adv. Sci. 2020, 1903463）。論文的第一作者兼通訊作者為哈佛大學(xué)博士生Yongcheng Wang，共同第一作者為北京大學(xué)博士生Ting Cao，共同通訊作者為哈佛醫(yī)學(xué)院的Ralph Weissleder教授和哈佛工學(xué)院的David Weitz教授。

論文鏈接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1002/advs.201903463

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