其次，未精確聚焦在液滴分選區(qū)域的高電場可能會導(dǎo)致不必要的雙重分選。基于DEP的液滴分選系統(tǒng)的電極通常是通過用鹽水或液態(tài)金屬填充微流體通道來制造的。不幸的是，這些類型的3D電極產(chǎn)生的電場沒有充分地定位在液滴分選區(qū)域內(nèi)，并且可能無意中致動多個相鄰的液滴。這些電極的大覆蓋面積也導(dǎo)致通道中心的高電場強度，這增加了兩個相鄰液滴無意中合并的可能性。為了避免對靠近的多個液滴進行分選，通常會注入間隔油以進一步分離連續(xù)的液滴，這只允許單個液滴在任何給定時間點進入有效的液滴分選區(qū)域。然而，在長時間的運行中，穩(wěn)定地保持液滴之間的均勻間距可能很困難，特別是在進入的液滴尺寸不均勻的情況下，因為較小的液滴往往會因動量和阻力的差異而趕上較大的液滴。具有較大的液滴間距也會降低整體系統(tǒng)吞吐量。

圖2:NOVAsort的設(shè)計和概念驗證。

最后，需要更高的電壓來實現(xiàn)更高的吞吐量。由于分選效率由給定DEP力下可實現(xiàn)的最大液滴位移決定，該位移取決于DEP力作用于每個液滴的幅度和時間，因此需要更高的DEP力將液滴重定向到不同的出口。然而，在高電壓下（現(xiàn)有液滴分選機的典型工作電壓范圍為200至1000Vpp），與液滴的表面自由能相比，液滴的慣性增加，當(dāng)向液滴施加位移力時，液滴保持其完整性，這可能會導(dǎo)致液滴撕裂。這種不必要的液滴分裂會嚴(yán)重混淆任何液滴分析的結(jié)果，也會限制分析吞吐量，特別是在相對較大的液滴（超過100?直徑為μm），其中這種較大的液滴通常更難操作，但在許多細(xì)胞分析應(yīng)用中仍然是必需的。

我們在本文中描述了NOVAsort（下一代基于光電體積的精確液滴分選器）系統(tǒng)，該系統(tǒng)不僅可以根據(jù)液滴的熒光強度，還可以根據(jù)其大小對液滴進行分選。即使在高通量條件下，精確分選多分散液滴群體也可以顯著減少或消除由液滴分裂和/或液滴合并等無意影響引起的分選誤差。所提出的液滴分選器有效地解決了上述缺點和局限性，它利用了交叉電極（IDE），可以在微流體通道的底部產(chǎn)生高度局部化的電場，還利用載體油中水滴的自然浮力來選擇性地操縱特定尺寸范圍內(nèi)的液滴。流通液滴熒光檢測裝置與反饋回路相結(jié)合，僅當(dāng)檢測區(qū)域中的液滴強度超過設(shè)定的熒光閾值時，才激活I(lǐng)DE，因此僅收集正確尺寸的高熒光液滴，因為表面IDE產(chǎn)生的DEP力只能操縱特定尺寸范圍內(nèi)的液滴。此外，平面IDE產(chǎn)生的高度局部化的電場僅移動位于IDE正上方的液滴，因此不會聚結(jié)相鄰的液滴或?qū)Ψ悄繕?biāo)液滴進行分類。此外，激活的IDE充當(dāng)“液滴導(dǎo)軌”，輕輕地將液滴引導(dǎo)到正確的出口，而不是傳統(tǒng)的液滴操縱器以銳角突然將液滴拉向不同的方向，這會導(dǎo)致液滴動量的突然變化，從而導(dǎo)致不必要的液滴剪切。最后，作為這種NOVAsort系統(tǒng)優(yōu)勢的概念驗證，進行了液滴體外轉(zhuǎn)錄/翻譯（IVTT）工作流程，并對由此產(chǎn)生的錯誤率和吞吐量進行了徹底的表征。

NOVAsort系統(tǒng)的工作原理

在多個步驟的液滴孵育和/或操縱操作后，液滴尺寸的均勻性可能會受到顯著影響。圖1A顯示了待分揀液滴庫的典型輸入液滴組成。在這里，液滴由小（破碎）、中（目標(biāo)尺寸）和大（無意聚結(jié)）液滴組成，有或沒有熒光。然而，只有中等大小的熒光陽性液滴才是真正需要分類的。NOVAsort旨在處理這種高度多分散的輸入液滴庫。這是通過將基于尺寸的液滴分離與熒光激活的液滴分選相結(jié)合來實現(xiàn)的（圖1B）。NOVAsort的程序如圖1C所示。基于尺寸的液滴分離方法基于這樣一個事實，即水滴在其載體油中自然漂浮并漂浮到通道頂部，位于通道底部的IDE在通道底部產(chǎn)生非常局部的電場。填充通道高度的大液滴可以很容易地通過介電泳（DEP）力進行操縱，而浮起并因此遠離表面IDE的小液滴由于作用在這些小液滴上的DEP力不足而無法操縱（圖1D）。在這項工作中，通道高度被設(shè)計為比所需的液滴尺寸稍大（約10%），以便IDE產(chǎn)生的局部電場專門影響和引導(dǎo)具有正確尺寸的液滴。通過順序連接兩個這樣的基于尺寸的液滴操縱器（圖2A顯示了串聯(lián)連接的液滴高通和低通濾波器），可以僅分選出特定的液滴尺寸范圍。熒光檢測激光點放置在第二對IDE的開頭，IDE產(chǎn)生DEP力，以選擇性地僅對熒光陽性和正確尺寸的液滴進行分類。

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