20世紀(jì)70年代，斯坦福大學(xué)的Stanley Cohen與加州大學(xué)的Herbert Boyer通過(guò)重組質(zhì)粒的方式，首次將異源基因成功轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中表達(dá)，這次DNA重組實(shí)驗(yàn)標(biāo)志著基因工程技術(shù)的誕生，也開(kāi)啟了重組蛋白光輝璀璨的歷史發(fā)展。1976年，Boyer等人創(chuàng)立了第一家基因工程公司基因泰克；1982年，基因泰克研發(fā)出世界上第一個(gè)利用基因重組技術(shù)表達(dá)的蛋白——重組人胰島素。時(shí)至今日，重組蛋白已經(jīng)在我們的生活中扮演著不可或缺的角色，其產(chǎn)品種類(lèi)眾多，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、食品、化工、科研試劑等諸多領(lǐng)域。

目前，重組蛋白微生物細(xì)胞工廠(chǎng)主要采用表達(dá)元件優(yōu)化和底盤(pán)菌株改造相結(jié)合的構(gòu)建流程。然而，由于生物系統(tǒng)的多層次結(jié)構(gòu)及復(fù)雜性，特別是缺乏系統(tǒng)理解基因組未知位點(diǎn)對(duì)重組蛋白合成及分泌的影響機(jī)制，現(xiàn)有的底盤(pán)菌株改造仍主要依賴(lài)于“試錯(cuò)”方法，開(kāi)發(fā)周期長(zhǎng)、成本高、產(chǎn)品生產(chǎn)效率低。因此，如何在全基因組范圍內(nèi)快速、高效地挖掘蛋白分泌關(guān)聯(lián)基因位點(diǎn)是提高微生物蛋白細(xì)胞工廠(chǎng)設(shè)計(jì)效率的重要研究方向。

近日，清華大學(xué)化工系生物育種技術(shù)與裝備團(tuán)隊(duì)和江南大學(xué)糧食發(fā)酵與食品生物制造國(guó)家工程研究中心白仲虎團(tuán)隊(duì)合作，在代謝工程領(lǐng)域國(guó)際知名期刊Metabolic Engineering上發(fā)表了題為“CRISPRi-microfluidics screening enables genome-scale target identification for high-titer protein production and secretion”的文章，論文通訊作者為清華大學(xué)張翀和江南大學(xué)劉秀霞。文章提出了“CRISPRi-微流控篩選”策略（圖 1），通過(guò)建立全基因組規(guī)模CRISPRi文庫(kù)，結(jié)合高通量的分泌蛋白表征技術(shù)和液滴微流控篩選平臺(tái)，在新興的重組藥物蛋白表達(dá)宿主——谷氨酸棒桿菌中繪制了蛋白分泌的基因型-表型關(guān)聯(lián)圖譜，系統(tǒng)地揭示了其基因組中能夠用于改善分泌蛋白生產(chǎn)的基因位點(diǎn)，并最終指導(dǎo)構(gòu)建了高效分泌重組蛋白的底盤(pán)菌株。

圖1 CRISPRi-微流控篩選的概述圖 谷氨酸棒桿菌是一種用于生產(chǎn)具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的蛋白的新興宿主生物。近年來(lái)，谷氨酸棒桿菌被廣泛應(yīng)用于重組藥物蛋白的生產(chǎn)，由味之素公司開(kāi)發(fā)的谷氨酸棒桿菌表達(dá)系統(tǒng)CORYNEX已成功商業(yè)化進(jìn)入市場(chǎng)。在這項(xiàng)研究中，研究團(tuán)隊(duì)首先設(shè)計(jì)構(gòu)建了谷氨酸棒桿菌中的第一個(gè)全基因組規(guī)模CRISPRi文庫(kù)，以46549條sgRNA實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組99.71%蛋白質(zhì)編碼基因和85.36%非編碼基因的遺傳擾動(dòng)；以納米抗體VHH作為模式分泌蛋白，使用建立的液滴微流控平臺(tái)對(duì)文庫(kù)中超過(guò)50萬(wàn)個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行了篩選。

通過(guò)三輪分選文庫(kù)的基因型分析，研究團(tuán)隊(duì)繪制了谷氨酸棒桿菌蛋白分泌的基因型-表型關(guān)聯(lián)圖譜（圖 2），揭示了包括氧化還原調(diào)控、氨基酸代謝、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體等生物過(guò)程中存在大量提高分泌蛋白產(chǎn)量的潛在靶點(diǎn)。

圖2 谷氨酸棒桿菌蛋白分泌的基因型-表型關(guān)聯(lián)圖譜

此外，研究人員通過(guò)重構(gòu)實(shí)驗(yàn)與表型性能評(píng)價(jià)明確了24個(gè)可以提高VHH產(chǎn)量的有效基因靶點(diǎn)，其中，抑制8個(gè)氨基酸代謝途徑中的基因靶點(diǎn)使VHH產(chǎn)量提高了8.8%~48.1%，抑制8個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體相關(guān)基因使VHH產(chǎn)量提高了4.3~48.1%；揭示了氧化還原相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子是影響谷氨酸棒桿菌分泌蛋白產(chǎn)量的重要基因位點(diǎn)，并通過(guò)氧還轉(zhuǎn)錄因子CosR和RshA的組合敲除構(gòu)建了 VHH產(chǎn)量提高2.78倍的底盤(pán)菌株，并用于I型骨膠原前肽和單鏈可變區(qū)片段scFv的高效分泌生產(chǎn)（圖 3）。

圖3 氧還轉(zhuǎn)錄因子工程構(gòu)建高效蛋白分泌菌株

值得注意的是，這項(xiàng)研究中利用的高通量篩選平臺(tái)是以雙砷-四半胱氨酸反應(yīng)為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的，其處理通量可達(dá)到》?105個(gè)單細(xì)胞/天。通過(guò)反應(yīng)體系和操作流程的優(yōu)化，成功在皮升級(jí)液滴水平建立了非酶依賴(lài)的分泌蛋白產(chǎn)量表征方法。

圖4 基于雙砷-四半胱氨酸反應(yīng)的液滴微流控篩選平臺(tái)，紅色虛線(xiàn)內(nèi)為三次微流控操作及相應(yīng)的實(shí)拍圖

由于CRISPR技術(shù)和基于雙砷-四半胱氨酸反應(yīng)的液滴微流控篩選平臺(tái)的普適性，該研究中的“CRISPRi-微流控篩選”平臺(tái)未來(lái)或被廣泛應(yīng)用于各種原核宿主和不同蛋白的分析，助力下一代微生物蛋白細(xì)胞工廠(chǎng)的創(chuàng)制。

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https://doi.org/10.1016/j.ymben.2022.12.004

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