1 染料定性表征濃度梯度

隨著熒光素鈉與莧菜紅流速比的增加, 熒光素鈉成分在通道中所占比例逐漸增加。當(dāng)流速比 < 1時, 莧菜紅在4個通道中含量較高(圖 2A~D); 當(dāng)流速比 > 1時, 熒光素鈉在4個通道中含量較高, 不利于拉開濃度差異, 形成濃度梯度(圖 2I~L、M~P); 當(dāng)兩水相流速比為1時(即流速均為100 μL·h-1), 芯片可以生成較好的濃度梯度, 接近于線性濃度梯度(圖 2E~H)。同時, 結(jié)果可以看出當(dāng)流速差異較大時, 兩水相分界清晰, 流體在流動過程中不能充分?jǐn)U散(圖 2I~L、M~P)。所以選擇兩水相流速均為100 μL·h-1作為后續(xù)藥物篩選實(shí)驗(yàn)時的水相流速。

2 HPLC定量表征濃度梯度

氟康唑在1~100 μg·mL-1內(nèi)線性良好, 回歸方程為f = 1 769.3×C - 1 507.3 (r = 0.999 7)。空白溶液與100 μg·mL-1氟康唑溶液流速比1:2、1:1、2:1, 分別收集4個通道樣本進(jìn)行檢測, 結(jié)果見表 1。當(dāng)流速為1:2和2:1時, 溶液流速差異大, 高流速溶液流經(jīng)同樣距離所需時長越短, 橫向擴(kuò)散距離也較短, 分支中溶液混合情況差, 難以形成線性濃度梯度。當(dāng)空白溶液與工作溶液流速比為1:1時, 各分支溶液能夠較充分混勻從而能夠獲得更加接近線性的濃度梯度, 與熒光素鈉對芯片濃度梯度定性結(jié)果一致。

3 濃度梯度微流控芯片的系統(tǒng)考察

為了生成大小均勻、形狀穩(wěn)定的液滴, 考察了芯片上的水油兩相流速, 見圖 3。結(jié)果表明, 水相流速100 μL·h-1、油相流速200 μL·h-1時, 液滴大小均一, 形態(tài)良好, 液滴直徑約為47 μm, 體積約54 pL, 生成速度約為每秒2.6×104個。收集的液滴涂布于載玻片上觀察, 液滴形態(tài)比較穩(wěn)定, 尺寸均一, 放置3天, 液滴仍能保持形態(tài)完好, 穩(wěn)定性高, 完全滿足實(shí)驗(yàn)要求。

4 液滴包裹白念珠菌考察

白念珠菌菌液與空白培養(yǎng)基作為兩水相包裹形成液滴后, 涂片于載玻片, 顯微鏡下拍照觀察。對液滴直徑進(jìn)行測量和標(biāo)記, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)液滴直徑基本為46.64 μm, 尺寸大小基本保持一致, 液滴均一性良好。白念珠菌經(jīng)活死染料標(biāo)記, 可以清晰地觀察到大多數(shù)液滴為空液滴, 而包裹了白念珠菌的液滴基本為單包裹。由于白念珠菌濃度為0.5×103~2.5×103 CFU·mL-1, 菌液濃度相對較低, 分散到每個液滴內(nèi)的白念珠菌基本為1個或沒有, 因此液滴絕大多數(shù)為單包裹(圖 4)。在單細(xì)胞包裹液滴中, 當(dāng)藥物抑制或者殺滅真菌細(xì)胞時, 無熒光亮液滴, 顯示與空液滴一樣的背景色。當(dāng)藥物濃度低于MIC時, 真菌細(xì)胞有生長活性, 指示劑轉(zhuǎn)化產(chǎn)生熒光亮液滴, 而空液滴保持不變。由此可以判斷藥物的MIC。因此, 通道內(nèi)白念珠菌的濃度梯度分布不影響后續(xù)的藥物篩選實(shí)驗(yàn)。

5 基于濃度梯度微流控芯片的抗真菌藥物快速篩選研究

分別測試高低濃度的兩性霉素B的抗白念珠菌作用, 高濃度組水相分別為含16.0 μg·mL-1兩性霉素B的藥物溶液和含終濃度為0.5×103~2.5×103 CFU·mL-1白念珠菌的溶液, 低濃度組兩性霉素B濃度為4.0 μg·mL-1, 其余組成相同。16.0 μg·mL-1兩性霉素B濃度梯度微流控芯片抗真菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖 5。空白對照組中液滴只包裹了藥物溶液(無菌), 可見液滴顏色均勻一致為背景的紅色, 液滴無熒光(圖 5A); 生長對照組(無藥), 熒光亮液滴較多(圖 5D), 圖 5B~C中液滴無熒光, 表明白念珠菌的活力被兩性霉素B抑制, 無法有效轉(zhuǎn)化熒光指示劑產(chǎn)生熒光。

4.0 μg·mL-1兩性霉素B液滴實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖 6, A~D分別為通道1、通道2、通道3、通道4出口處收集液滴孵育2 h后的結(jié)果。根據(jù)氟康唑濃度梯度定量表征結(jié)果推算, 圖 6A~D中兩性霉素B分別為4.0、1.6、0.5和0 μg·mL-1。A為空白對照組, 無熒光亮液滴; D為正常生長對照組, 產(chǎn)生大量亮液滴。圖 6B中所示為藥物溶液與菌溶液混合后的液滴作用情況, 液滴中無明顯熒光信號產(chǎn)生, 表明該濃度條件兩性霉素B可以有效抑制白念珠菌生長, 兩性霉素B濃度約為1.6 μg·mL-1; 圖 6C中可以看到液滴存在明顯的明暗區(qū)別, 表明液滴內(nèi)包裹的白念珠菌未能被有效抑制, 而兩性霉素B濃度約為0.50 μg·mL-1, 因此可以得出兩性霉素B的MIC值在0.50~1.60 μg·mL-1內(nèi), 與CLSI所建議的兩性霉素B對白念珠菌的MIC≤1 μg·mL-1相一致。結(jié)果表明本研究建立的濃度梯度微流控芯片平臺可以用于快速測定抗真菌候選化合物的MIC, 通過一次實(shí)驗(yàn)獲得化合物的MIC范圍(表 2)。

氟康唑、卡泊芬凈、特比萘芬等藥物結(jié)果與96孔板法一致。圖 7顯示了16 μg·mL-1特比萘芬抗白念珠菌藥物篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中, 7B~D中均有熒光亮液滴, 說明兩種濃度的特比萘芬均不能有效抑制該批次白念珠菌的活性, 該批次白念珠菌對特比萘芬產(chǎn)生了耐藥的現(xiàn)象。有文獻(xiàn)報(bào)道, 在臨床獲得的白念珠菌樣品中, 對特比萘芬的耐藥比例達(dá)94.93%, 而伊曲康唑和咪康唑的耐藥率則只有15.21%和5.99%。本研究所建立的抗白念珠菌藥物篩選的方法也可以應(yīng)用于臨床耐藥菌株的藥物篩選研究。

討論

在微流控芯片上生成濃度梯度具有自動化、微型化、高通量的優(yōu)點(diǎn), 因此被廣泛應(yīng)用于藥物篩選、細(xì)胞生物學(xué)等研究領(lǐng)域。本研究采用液滴微流控技術(shù)結(jié)合濃度梯度生成的芯片包裹白念珠菌進(jìn)行抗真菌藥物活性快速高效測試。通過熒光示蹤劑熒光素鈉和莧菜紅色素考察芯片上兩水相流速比對濃度梯度形成結(jié)果的影響, 并對芯片濃度梯度進(jìn)行了定性表征, 結(jié)合HPLC對通道內(nèi)氟康唑濃度的定量從而對芯片濃度梯度進(jìn)一步進(jìn)行定量表征。濃度梯度定性與定量結(jié)果一致表明, 當(dāng)兩水相流速比為1 : 1時, 流速為100 μL·h-1時, 芯片內(nèi)濃度梯度分布更加均勻, 濃度梯度分布接近線性, 適用于后續(xù)藥物篩選實(shí)驗(yàn)。通過活死染色考察芯片上濃度梯度生成器對白念珠菌在通道中分布及液滴內(nèi)包裹白念珠菌情況的影響, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)液滴內(nèi)白念珠菌基本為單包裹, 藥物作用對象保持一致。

采用本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)制作的濃度梯度液滴微流控芯片, 測試了8種臨床常用藥物的抗白念珠菌作用效果。通過對兩性霉素B、氟康唑及特比奈芬等藥物的作用效果考察發(fā)現(xiàn), 芯片結(jié)果與孔板法一致, 并與M27-A3標(biāo)準(zhǔn)所認(rèn)定的MIC值相符, 表明本研究建立的多濃度梯度液滴生成芯片平臺可以用于抗真菌活性化合物的快速篩選及臨床耐藥菌株的篩選研究。傳統(tǒng)孔板法藥敏實(shí)驗(yàn)需要耗費(fèi)大量人力物力, 難以實(shí)現(xiàn)高通量分析。

近年來, 濃度梯度微流控芯片技術(shù)逐漸興起, 出現(xiàn)大量能夠產(chǎn)生線性和非線性濃度梯度的微流控芯片, 但其結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)較為復(fù)雜、制作要求較高, 芯片穩(wěn)定性和重現(xiàn)性易受影響。本文建立的濃度梯度液滴微流控芯片平臺將濃度梯度生成器和液滴生成結(jié)構(gòu)組合在一起, 濃度梯度生成器采用經(jīng)典的“圣誕樹”結(jié)構(gòu), 可通過簡單地增加分支數(shù)目而獲得更多的濃度梯度分布, 結(jié)構(gòu)簡單易于制作, 并且芯片穩(wěn)定性高, 易于操作, 能夠快速生成較為精確、穩(wěn)定的濃度梯度。將該平臺應(yīng)用于抗真菌藥物篩選, 可以省去配制多種不同藥物濃度溶液的繁冗過程, 同時簡化了細(xì)胞鋪板、給藥、標(biāo)記等過程。在短時間內(nèi)可以生成大量液滴, 每個液滴作為獨(dú)立微反應(yīng)器, 作用結(jié)果互不干擾, 增加了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性與準(zhǔn)確性。后期通過改進(jìn)芯片“圣誕樹”結(jié)構(gòu)濃度梯度分支數(shù)目, 增加芯片的濃度梯度生成數(shù)量, 可以將一次實(shí)驗(yàn)所獲得的濃度梯度間隔劃分的更小, 有望通過一次實(shí)驗(yàn)獲得精確的MIC值; 通過改變濃度梯度生成器結(jié)構(gòu), 可以產(chǎn)生正交濃度梯度用于聯(lián)合用藥的研究。

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