作為液體活檢的重要標志物之一,循環腫瘤細胞(CTCs)在外周血中的含量可以用來輔助判斷患者的癌癥病發狀況。除此以外,CTCs對于腫瘤細胞轉移行為等基礎研究也具有非常重要的意義。然而人體血液中的CTCs含量極其稀少,通常僅有0~10個/mL,與之相對,紅細胞、白細胞和血小板的含量則分別達到5×109 個/mL、4×106 個/mL和3×108 個/mL,而且腫瘤細胞在轉移過程中可以通過上皮-間質轉化(EMT)和間質-上皮轉化(MET)來不斷地改變自身的特征。正是由于其稀缺性和異質性,以及血液中復雜基質的干擾,CTCs的精準檢測成為巨大的難題。

由于常規的光學分析手段在檢出限和靈敏度上均難以達到直接檢測的要求,因此通常在進行外周血中CTCs的檢測之前,要通過一些樣品前處理方法來實現其分離和富集。常采用的樣品前處理方法可以分為物理法和化學法,物理法主要根據細胞在物理特征上的差異來進行分離,例如膜過濾分離和密度梯度離心,就是分別依據細胞的大小和密度來完成篩選。化學法則主要依靠生物大分子的特異性識別作用,例如抗原抗體相互作用,核酸適配體與靶標的選擇性結合。

上述樣品前處理方法雖然能夠在不同程度上實現CTCs的分離富集,但也存在著一定的缺陷。由于這些方法都是非連續性的,在吸附、洗脫和轉移的過程中難免會造成細胞的丟失,加之CTCs本身的稀缺性,很容易導致假陰性結果的產生。利用微流控芯片功能集成的特點則可以很好地解決這一問題,CTCs的捕獲、釋放、計數及檢測等操作均可在芯片上完成,連續的自動化處理可以有效減少人為誤差的干擾。此外,微流控芯片所需要的進樣量非常小,可以大大減少珍貴樣品和試劑的消耗,降低檢測成本。并且在微尺度下表面力的作用會明顯放大,可以有效提高物質混合和反應的效率,實現快速高效的分離分析。因此,近年來多項研究嘗試利用微流控芯片平臺開展CTCs分離檢測工作,取得了良好的效果。本文對微流控芯片技術用于CTCs分離檢測的相關研究進展進行了綜述,將采用的分離方法主要分為物理篩選和生物親和兩大類,同時囊括正向富集和反向富集兩種策略。此外,對于近期發展的芯片原位檢測CTCs新方法也進行了介紹。

1、CTCs分離芯片研究進展

作為商品化較為成功的CTCs分離檢測系統,強生公司的CellSearch產品采用的是基于上皮細胞黏附分子(EpCAM)抗體特異性識別腫瘤細胞的方法,類似的方法在CTCs分離芯片中也被廣泛使用,可以視作利用生物親和作用進行CTCs分離富集的代表。

另一方面,依據細胞在物理性質方面的差異,無須生物標志物的條件下即可實現CTCs的篩選,其中有無外力介入的被動分離方法,例如利用微尺度下流體力學中的慣性效應和黏彈性效應來進行篩分。

也有外加物理場的主動分離方法,諸如介電泳、表面聲波和光鑷技術等。除了直接對CTCs進行特異性識別實現正向富集外,也可以通過選擇性結合諸如白細胞等干擾,再將其排除,從而達到反向富集的效果。

2、芯片原位CTCs檢測

對于CTCs的檢測,通常采取先進行細胞染色,再用熒光顯微鏡觀察的方法,但該方法在靈敏度上有待提高,且重現性較差,需要手動操作和人工計數。

此外,以熒光光譜為代表,一些常見的光譜檢測手段也被廣泛應用在芯片上CTCs的檢測中。

除了光學分析方法外,研究人員通過使用傳感元件實現了CTCs芯片檢測結果的數字化直讀或可視化分析。

3、總結與展望

本文對CTCs分離微流控芯片的技術原理、分離策略和研究進展進行了綜述。其技術原理主要分為物理篩選和生物親和兩大類,分離策略分為正向富集和反向富集兩個方向。同時,介紹了CTCs芯片原位檢測的主要技術方法和優化策略。隨著微流控芯片技術的快速發展,其微尺度流體操控、微結構加工和集成傳感檢測能力得到極大提升,進一步推動了CTCs分離微流控芯片技術的發展。多項研究顯示,以微流控芯片為平臺來分離檢測外周血中的CTCs,可以充分發揮芯片本身微量、高效、易于自動化和集成化的優勢,最終實現對臨床血液中CTCs的快速精準分析,在腫瘤早期診斷、復發與轉移監測以及抗腫瘤藥物評價等多個領域具有重要的應用空間。

現階段,CTCs芯片在篩選精度和篩選效率方面仍存在較大的提升空間。針對這一挑戰,由于精準與高效二者難以兼得,未來的芯片設計應該更專注于單個目標的實現。一方面,針對基礎研究,應當注重于提高CTCs篩選的細胞純度及細胞活性。可以先利用慣性效應對血液進行粗分離,篩分出尺寸較大的白細胞和CTCs。再采用液滴分選的方法,通過免疫磁性分離實現CTCs的精確篩選。液滴分選技術能夠達到單細胞分析的精度,利用液滴分選進行腫瘤細胞篩選也已有文獻報道。另一方面,針對臨床檢測領域,研究重點則在于實現臨床樣本的高通量分析。可以采用電分析方法,依據不同種類細胞的比膜電容和細胞質電導率差異來設置恰當的閾值,對流經檢測窗口的CTCs實現快速分析。此外,微流控芯片技術屬于多學科交叉領域,CTCs芯片的發展同時也受益于微機電系統(MEMS)、材料學、流體力學和生物醫學等研究領域的技術突破。隨著相關領域研究技術的發展,CTCs芯片未來有望成為腫瘤基礎研究和癌癥早期臨床診斷的重要平臺。

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