隨著科技的發(fā)展，通過(guò)抽取少量血液來(lái)分析腫瘤信息的“液態(tài)活檢”已經(jīng)逐漸具有趕超和替代傳統(tǒng)活檢的趨勢(shì)。

液態(tài)活檢的來(lái)源包括CTC（循環(huán)腫瘤細(xì)胞）、ctDNA（循環(huán)腫瘤DNA）、microRNA（循環(huán)microRNA）、Exosome（外泌囊泡小體）等四種，前面兩種目前在業(yè)界相對(duì)熱門(mén)。本文將重點(diǎn)介紹液態(tài)活檢之CTC的捕獲與鑒定。

圖1.液態(tài)活檢

1.循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）--基于微流控的全自動(dòng)化體外診斷儀器設(shè)備

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）被定義為自發(fā)或因診療操作脫離實(shí)體瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。目前CTC的應(yīng)用主要在以下幾個(gè)方面：

1)在常規(guī)手段無(wú)法對(duì)早期腫瘤進(jìn)行判斷時(shí)進(jìn)行輔助診斷。

2) 在療效評(píng)估方面，癌癥患者進(jìn)行化療、靶向治療后進(jìn)行CTC 檢測(cè)，若CTC 數(shù)量減少，提示治療方式可能有效。相比于現(xiàn)階段的檢查手段，CTC 檢測(cè)技術(shù)操作更方便，應(yīng)用更簡(jiǎn)單，可以更及時(shí)地提示醫(yī)生該患者是否適合化療或靶向治療。

3) 在術(shù)后監(jiān)測(cè)方面，主要是由于活檢無(wú)法高頻次檢測(cè)，而目前CTC 檢測(cè)在術(shù)后監(jiān)測(cè)中應(yīng)用可能更方便，檢測(cè)頻次會(huì)更高。

圖2.CTC在癌癥治療中的應(yīng)用場(chǎng)景

2.循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）的特性

1.稀有性：每10mL血液中可能僅含有幾個(gè)到幾十個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞。

2.非典型性的細(xì)胞形態(tài)：一般比血液細(xì)胞，正常組織細(xì)胞體積大；細(xì)胞核大，不規(guī)則，細(xì)胞核質(zhì)比高；不易發(fā)生變形。

3.異質(zhì)性：細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物表達(dá)差異；攜帶不同的分子信息；轉(zhuǎn)移潛力差異。

4.不同形態(tài)和類別：CTC可以是間質(zhì)型、上皮型或者上皮間質(zhì)混合型，CTC也既可以是單個(gè)細(xì)胞的CTC也可以是成團(tuán)的CTCs(CTM)。

圖3.CTC的分類

3.CTC的富集

人體循環(huán)系統(tǒng)中CTC的含量極低,腫瘤轉(zhuǎn)移患者每毫升全血中僅有1～10 個(gè)CTC，因此要實(shí)現(xiàn)CTC的檢測(cè)對(duì)其進(jìn)行分選富集是一個(gè)必不可少的步驟。CTC分選富集效果的優(yōu)劣將會(huì)直接影響其后續(xù)的檢測(cè)(計(jì)數(shù)、基因擴(kuò)增、基因測(cè)序等)效果,因此高純度、高靈敏性(不丟失CTC)、快速、高細(xì)胞活性的CTC分選富集是CTC臨床應(yīng)用的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

圖4.CTC的檢測(cè)流程圖

CTC 的富集方法可以分為免疫親和富集法和物理特性富集法。免疫親和法主要是根據(jù)細(xì)胞表面表達(dá)的特異性的蛋白將CTC篩選出來(lái)，物理特性富集主要是根據(jù)CTC 的大小和密度等特性將這些細(xì)胞篩選出來(lái)。

圖5.CTC的富集方法

圖6.常用CTC富集技術(shù)比較

3.1免疫親和捕獲法

免疫捕獲法的原理是將特異性抗原包被在已有同源抗體的磁珠上制成免疫磁珠再與靶細(xì)胞上抗原結(jié)合成“靶細(xì)胞—抗原抗體—磁珠”復(fù)合物，在磁場(chǎng)作用下向一定方向移動(dòng)，從而富集靶細(xì)胞。免疫捕獲法又分為陽(yáng)性富集，陰性富集和流式細(xì)胞術(shù)三種方法。

3.1.1陽(yáng)性富集

使用表面耦聯(lián)抗目的細(xì)胞抗體的磁珠，細(xì)胞與磁珠結(jié)合后直接在磁場(chǎng)中被分離出來(lái)。其中的典型代表是CellsearchTM系統(tǒng)，CTC芯片（CTCs-chip）和MACS?Cell Separation 磁性細(xì)胞分選系統(tǒng)。

原理：采用抗EpCAM結(jié)合免疫磁珠捕獲EpCAM陽(yáng)性CTC。

優(yōu)點(diǎn)：捕獲的CTC純度較高；能夠捕獲到血液中上皮型、上皮間質(zhì)混合型的CTC。

缺點(diǎn)：無(wú)法捕獲到間質(zhì)型CTC（EpCAM陰性）。

圖7.陽(yáng)性富集—CTCs-Chip

3.1.2陰性富集

用特異性抗體CD45，CD14 等與白細(xì)胞結(jié)合，從而去除全血中的白細(xì)胞。典型代表是Cyttel/Cytelligen檢測(cè)系統(tǒng)。

原理：利用CD45磁珠抗體吸附白細(xì)胞，在磁場(chǎng)作用下去除白細(xì)胞，CTC被富集沉淀。

優(yōu)點(diǎn)：可檢出EpCAM、CK陰性的間質(zhì)型CTC。

缺點(diǎn)：樣本處理步驟多，CTC易丟失。

圖8.陰性富集法—Cyttel

3.1.3流式細(xì)胞術(shù)

原理：根據(jù)白細(xì)胞表達(dá)CD45抗原、CK陽(yáng)性CTCs表達(dá)EpCAM，采用不同熒光素標(biāo)記的抗CD45和抗EpCAM，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析和分選CK陽(yáng)性細(xì)胞的CTC。

優(yōu)點(diǎn)：可在檢測(cè)的同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)、DNA倍數(shù)分析。

缺點(diǎn)：敏感性較低，需要的血液樣本量大，缺乏規(guī)范的臨床操作方法。

3.2物理特性富集法

3.2.1濾膜法

濾膜法根據(jù)腫瘤細(xì)胞的體積大于白細(xì)胞體積分離CTC。其典型代表是濾膜濾法分離上皮源腫瘤細(xì)胞（ISET）。

原理：將全血經(jīng)過(guò)帶小孔8um的聚碳酸酯膜的過(guò)濾，即可除去白細(xì)胞富集得到CTC。

優(yōu)點(diǎn)：分離后細(xì)胞完整性好；可完全分離上皮型、間質(zhì)型CTC；可檢出循環(huán)腫瘤拴子。

缺點(diǎn)：不宜檢出細(xì)胞直徑小于8um的腫瘤如神經(jīng)內(nèi)分泌瘤。

3.2.2密度梯度離心

密度梯度離心法是根據(jù)腫瘤細(xì)胞與白細(xì)胞密度不同，通過(guò)梯度離心分離CTC。其典型代表是OncoQuick分離體系。

原理：在密度梯度離心后，白細(xì)胞通過(guò)多孔濾膜被濾除，而CTC被富集在介質(zhì)層中，洗脫后得到CTC。

優(yōu)點(diǎn)：可分離CK陽(yáng)性和陰性細(xì)胞。

缺點(diǎn)：CTC遷移可能至血漿層、紅細(xì)胞層和粒細(xì)胞層而丟失；CTC微栓子可能沉入紅細(xì)胞層而丟失；與腫瘤細(xì)胞特性、離心時(shí)間和溫度等有關(guān)；用血量多，一般需要15-30ml血。

圖9.密度梯度離心法

4.CTC的分析與鑒定

利用免疫親和或物理特性法可富集到CTC，接下來(lái)還需要結(jié)合有效的下游分析方法。一方面，由于目前CTC捕獲技術(shù)不能保證百分之百的純度，需要對(duì)所得到的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，以進(jìn)一步確定CTC細(xì)胞的數(shù)目，以減少CTC數(shù)目判定的假陽(yáng)性率和假陰性率。另一方面，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，不僅CTC的數(shù)目在動(dòng)態(tài)的變化，CTC所攜帶的分子標(biāo)志物也在變化，通過(guò)對(duì)CTC表面標(biāo)志物檢測(cè)，能夠反應(yīng)腫瘤發(fā)生發(fā)展的動(dòng)態(tài)變化，是研究腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的有效策略，并能很好地指導(dǎo)臨床治療。常用的CTC檢測(cè)技術(shù)如免疫熒光、PCR、FISH及高通量測(cè)序等。

1. 免疫熒光法（IF）: 實(shí)體腫瘤細(xì)胞一般均為上皮來(lái)源，細(xì)胞內(nèi)會(huì)表達(dá)角蛋(cytokeratin, CK)或其他腫瘤標(biāo)示物(如HER2)。借助免疫熒光染色，可對(duì)來(lái)自實(shí)體瘤CTC中的瘤標(biāo)進(jìn)行識(shí)別，從而達(dá)到檢測(cè)CTC的目的。這也是目前檢測(cè)CTC的最常見(jiàn)方法。缺點(diǎn)是，在CTC形成過(guò)程的間質(zhì)化(EMT)階段，大量的CK會(huì)降解，從而在CTC檢測(cè)過(guò)程中出現(xiàn)假陰性。

2. 熒光原位雜交（FISH）: 熒光原位雜交，是根據(jù)已知細(xì)胞內(nèi)特異的DNA序列，以利用熒光標(biāo)記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，與細(xì)胞內(nèi)的基因組中DNA分子雜交，檢測(cè)該特異基因序列的存在與豐度。FISH技術(shù)與CTC結(jié)合，不僅可以檢測(cè)CTC表面標(biāo)志物，也可以檢測(cè)CTC細(xì)胞內(nèi)部的標(biāo)志物及核型等。

3. RT-PCR，反轉(zhuǎn)錄PCR: 提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用引物和逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測(cè)的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。結(jié)合RT-PCR可同時(shí)對(duì)若干個(gè)基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。位點(diǎn)特異性PCR技術(shù)可用于檢測(cè)CTC攜帶的驅(qū)動(dòng)基因的突變情況。

二代測(cè)序 : CTC數(shù)量少，直接進(jìn)行二代測(cè)序難度大。需要將單細(xì)胞的DNA擴(kuò)增后，再利用二代測(cè)序檢查基因序列。但是，目前單細(xì)胞測(cè)序的技術(shù)僅僅停留在實(shí)驗(yàn)室階段，未來(lái)向市場(chǎng)推廣還有很長(zhǎng)的路要走。而且由于腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，單細(xì)胞測(cè)序是否有代表性還需要更多的科學(xué)研究來(lái)證明。

圖10.CTC檢測(cè)技術(shù)比較

（文章來(lái)源:微信 體外診斷網(wǎng) 作者：湯明輝 轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系刪除）

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