大家好！為大家介紹一篇2019年發表在Nat. Biomed.Eng.上的文章，題目為“Leukocyte function assessed via serialmicrolitre sampling of peripheral blood from sepsis patients correlates with disease severity”。本文主要介紹了一種慣性微流控系統，用于從較少量敗血癥患者外周血中白細胞的分離和下游分析。通訊作者是來自哈佛大學醫學院的Bruce D. Levy教授，研究興趣是微流控方向的醫療設備開發與疾病診斷。

【背景介紹】

敗血癥引起的炎癥性異常，是病原體感染致死的首要原因。在健康的患者中，中性粒細胞和單核細胞是該病癥早期的應答者，在抵抗病原體、限制組織損傷、促進器官功能恢復和體內平衡等方面具有重要作用。一般情況下，監控敗血癥患者情況主要通過觀察臨床狀況和外周血中白細胞計數，但該方法無法獲得白細胞功能的相關信息，不能準確地評估療效。此外，也可通過序貫器官衰竭估計評分（SOFA）評價敗血癥嚴重程度，但是該方法的誤診率較高（~30%），且無法提供病理學信息；或采用即時檢測型微流控芯片檢測循環細胞因子等，但依然無法有效地預測疾病的嚴重程度。由于白細胞必須結合各種不同的環境信號來做出保護型功能反應，它們的活性和功能可以作為疾病的細胞生物標志物。對白細胞的下游分析，可以為人類敗血癥和炎癥性疾病的治療提供新的策略。然而，頻繁地進行全血細胞計數可能會導致患者貧血，尤其是重癥患者。因此，開發樣品需求量較少的白細胞分析檢測方法具有重大意義。

【設計思路】

本文中所用無標記分離白細胞的慣性微流控系統如圖1所示，全血用量為50 μL。所用微流控芯片為螺旋芯片，其特別之處在于其螺旋通道的橫截面為梯形，如圖1a中X和Y截面圖所示。螺旋型流道的外側部位（接至OW outlet）高于內側部位（接至IW outlet），造成流道內外側的流體線速度不同。稀釋后的血樣注入流道后，不同尺寸的細胞在迪恩曳力和慣性升力的共同作用下發生重排，尺寸較大的白細胞傾向于沿流道高度較小的流道內側遷移，而尺寸較小的紅細胞將沿流道外側遷移，逐漸實現白細胞與紅細胞的分離。從OW outlet流出的紅細胞直接進入廢液管中，而從IW outlet收集的白細胞，又再次反饋至樣品管，重新進入螺旋芯片再次分離，直至獲得較高純度的白細胞。

圖1 慣性微流控系統用于分離全血中的白細胞原理圖，及其與密度梯度離心法分離效果的對比

【數據介紹】

1. 多型核中性粒細胞的分離及其在敗血癥患者和健康人中的作用作者首先測定了多型核中性粒細胞（PMN）表面的CD11b，CD66b和CD18的表達量，以評估慣性微流控芯片對PMN激活性質的影響。結果顯示，慣性微流控芯片分離獲得的PMN激活水平與處理前的細胞無顯著差異，且均顯著低于通過密度梯度離心法獲得的PMN，表明慣性流微流控芯片比密度梯度離心法更適合用于分離全血中的白細胞。為研究經慣性流微流控芯片分離后的PMN的應激能力，以確定該微流控芯片對PMN活性的影響，作者分別測定了PMN的脫顆粒作用、NADPH氧化酶組裝和吞噬溶酶體的形成。作者通過測定經十四烷酸佛波醇酯（PMA）刺激后的PMN中彈性蛋白酶釋放水平，以評估PMN的脫顆粒作用，結果發現從健康人全血中獲得的PMN經PMA刺激后彈性蛋白酶釋放水平顯著提高，且具有劑量依賴性（圖2a）。此外，白三烯B₄（LTB₄）刺激也可顯著提高PMN彈性蛋白酶的釋放水平。進一步地，作者分析了敗血癥患者血液中獲得的PMN的應激性。結果發現經LTB₄刺激后，從敗血癥患者血液中分離的PMN彈性蛋白釋放酶水平顯著低于健康人的PMN。但經PMA刺激后，敗血癥患者和健康人PMN的彈性蛋白釋放酶水平相當（圖2b和c）。

 2. PMN亞群的研究作者通過測定敗血癥患者和健康人血液中PMN表達CD16的情況，研究了PMN的亞群分布。結果發現敗血癥患者血液中CD16^-和中表達CD16的PMN比例升高，而高表達CD16的PMN比例降低，且發現CD16^-和中表達CD16的PMN比例與敗血癥的嚴重程度正相關，而高表達CD16的PMN比例與疾病嚴重程度負相關。

圖2 中性粒細胞亞群（PWN）及其在敗血癥和健康患者中的作用

3.等介電法分離敗血癥患者和健康人血液中PMN等介電法（IDS）可測定PMN的等電位，以鑒別靜息細胞和激活細胞。因此本文中采用IDS法分析了敗血癥患者和健康人血液中的PMN，以期通過IDS鑒別敗血癥患者和健康人。結果發現，敗血癥患者血液中未激活的PMN的等電位顯著低于健康人血液中的PMN（圖3c和d）。而經PMA激活后，健康人的PMN的等電位將降低至敗血癥患者的水平。進一步地，作者還發現，PMN的等電位與敗血癥嚴重程度負相關（圖3f）。

圖3 IDS法鑒定敗血癥患者和健康人血液中PMN的等電位

4.敗血癥患者和健康人血液中單核細胞亞群單核細胞在敗血癥發生過程的宿主反應中有重要作用。因此本文中還分離獲得了單核細胞。經流式細胞術檢測，確認慣性流微流控芯片對單核細胞在全部白細胞中的比例沒有影響。隨后，作者通過分析CD45⁺ FSC⁺ SSC^?以及CD14和CD16水平，以研究單核細胞的亞群（圖4a）。結果發現，敗血癥患者血液中中間單核細胞的比例顯著高于健康人，而經典單核細胞比例卻顯著低于健康人，但兩者的非經典單核細胞比例無顯著差異（圖4a和b）。進一步分析發現，經典單核細胞的比例與敗血癥嚴重程度呈反相關（圖4c）。

圖4 敗血癥患者和健康人血液中單核白細胞亞群分析

5.敗血癥患者的臨床癥狀與白細胞參數的主成分分析作者利用主成分分析法分析了敗血癥患者血細胞（包括總白細胞、PMN、帶細胞和單核白細胞）、臨床疾病嚴重程度、白細胞表型亞群和白細胞功能的相關性。結果發現，利用血細胞參數無法區分敗血癥患者和健康人（圖5a）；采用臨床疾病嚴重程度指標綜合評分，包括血壓、人工呼吸需求、APACHE II和SOFA評分，確實可以區分敗血癥患者和健康人（圖5c和d）。更重要的是，采用白細胞表型標志物的綜合評分，不但能準確鑒別敗血癥患者和健康人，還能診斷敗血癥的患病時間（圖5e~h）。此外，高表達CD16的PMN、經典單核細胞和白細胞和PMN功能性應激的綜合評分，以及PMN功能性應激和等電位的綜合評分，均可有效區分敗血癥患者和健康人。

圖5 主成分分析用于研究敗血癥患者嚴重程度與白細胞參數相關性

【總結】

本文中開發了一種慣性微流控芯片平臺，用于從微升級別的全血樣品中，無標記地分離出白細胞。該方法具有所需樣品量少、耗時短、對白細胞應激性能影響小等優勢。進一步地，利用該芯片分離獲得的白細胞（包括PMN和單核細胞），分析了白細胞數量、等電位、亞群占比等與敗血癥嚴重程度的相關性，發現采用白細胞表型標志物的綜合評分，不但能準確鑒別敗血癥患者和健康人，還能診斷敗血癥的患病時間，為敗血癥的診斷和療效評估、預后等提供了新方法。

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41551-019-0473-5

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