【引言】

超靈敏檢測和病原體的快速鑒定對于通過用適當(dāng)?shù)目股刂委焷砀纳苹加屑?xì)菌感染的患者的存活率是至關(guān)重要的。目前細(xì)菌血液培養(yǎng)的臨床標(biāo)準(zhǔn)需要大量的血液樣本和繁瑣的培養(yǎng)和微生物表型鑒定，并且整個鑒定過程非常耗時（幾天甚至幾周）并且通常取決于操作者的專業(yè)知識。作為替代方案，一些基因型方法，例如實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和熒光原位雜交（FISH）可以有效地將測定時間減少至血培養(yǎng)陽性后數(shù)小時（約6-10小時）。然而，有限的檢測靈敏度和特異性以及由大量周圍非目標(biāo)物種產(chǎn)生的高背景信號仍然阻礙它們的廣泛使用。然而，所有這些常規(guī)方法在一定程度上涉及復(fù)雜和費(fèi)力的樣品處理（例如細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞裂解，核酸提取和PCR擴(kuò)增），使得臨床樣品的高通量分析難以進(jìn)行。另外，多種細(xì)菌病原體可以共存，但通常在血液中以低水平存在（例如，<1-100CFU/mL）。因此，非常需要開發(fā)用于臨床診斷中病原菌的高通量鑒別的快速，多重和超靈敏方法。

基于液滴的微流體技術(shù)為單細(xì)胞水平的高靈敏度生物檢測和分析提供了一個很有前途的平臺，例如基因組分析，分泌表型篩選和多重染色質(zhì)相互作用分析。鑒于其能夠通過物理和化學(xué)隔離將少量細(xì)胞限制在離散液滴中，這種方法也適用于細(xì)菌檢測，可以直接從稀釋血液中快速檢測細(xì)菌，具有單細(xì)菌敏感性。然而，由于缺乏有效的信號放大，該方法不允許檢測病原體的低豐度生物標(biāo)記物。此外，對于多種病原體和易感性模式的同時鑒定和多重檢測仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。雖然標(biāo)記具有不同熒光顏色的多個傳感器將允許同時多路檢測多種病原體，但是它們的多路復(fù)用能力通常受到可在有效范圍內(nèi)明確檢測到的有限數(shù)量的光譜顏色的限制。因此，開發(fā)用于基于液滴的病原體檢測的超多重策略是非常需要的。

【成果簡介】

近日，華東師范大學(xué)裴浩教授課題組提出了一種平臺技術(shù)，可用于超高通量細(xì)菌檢測的一步法，快速和超多重方法。SDwalkers允許將具有熒光強(qiáng)度和發(fā)射波長的液滴編碼用于同時識別和多重檢測病原體的二維（2D）條形碼。該策略將極大地擴(kuò)展基于液滴微流體的多路復(fù)用能力，用于細(xì)菌檢測并有益于其他生物測定應(yīng)用。此外，SDwalkers的酶驅(qū)動級聯(lián)反應(yīng)提供了兼容的信號放大程序，大大提高了檢測活細(xì)菌的靈敏度，同時具有單細(xì)菌適用性，而不會犧牲多重信號放大的質(zhì)量。值得注意的是，作者成功地將這種SDwalker-Drop策略與商業(yè)流式細(xì)胞儀（FCM）整合用于臨床樣品分析，其結(jié)合了液滴微流體用于快速檢測的益處，用于超多重液滴編碼和超靈敏生物測定的SDwalkers以及用于多參數(shù)FCM的多參數(shù)FCM超高通量篩選?？偠灾?，SDwalker-Drop平臺為多重分子檢測提供了強(qiáng)大的工具，有利于臨床診斷，環(huán)境分析和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)。該成果以題為“Stochastic DNA Walker in Droplets for Super-Multiplex Bacteria Phenotype Detection”發(fā)表在Angew. Chem. Int. Ed.上。

【圖文導(dǎo)讀】

Figure 1.用于超復(fù)合細(xì)菌表型的SDwalker-Drop平臺的示意圖

Figure 2.基于SDwalker的傳感器用于細(xì)菌檢測

（a）SDwalker傳感器的工作原理

（b）通過TIRF實(shí)時監(jiān)測單個SDwalker傳感器

（c）SDwalker在不同濃度的MRSA存在下的熒光響應(yīng)

（d）SDwalker對不同細(xì)菌的熒光響應(yīng)

Figure 3.使用基于SDwalker-Drop的顏色或強(qiáng)度編碼條形碼對細(xì)菌進(jìn)行多重分析

（a）分別記錄在藍(lán)色，綠色和紅色通道中的顏色編碼條形碼的熒光光譜和圖像

（b）用于細(xì)菌的超多重分析的強(qiáng)度編碼條形碼的示意圖

（c）通過強(qiáng)度編碼條形碼可視化分析結(jié)果，以鑒定含有不同細(xì)菌類型的混合物

（d）樣品S1-S7的熒光強(qiáng)度

Figure 4. 使用基于SDwalker-Drop的顏色和強(qiáng)度編碼條形碼進(jìn)行實(shí)際樣品分析

（a）用于實(shí)際樣本分析的SDwalker-Drop方案

（b）六個實(shí)際樣品的熒光強(qiáng)度的散點(diǎn)圖

【小結(jié)】

在這個工作中，作者開發(fā)了一種基于SDwalker-Drops的超級多路復(fù)用編碼技術(shù)。這種用于細(xì)菌分析的方法具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：（i）由于酶信號放大，酶驅(qū)動的SDwalker能夠以高靈敏度進(jìn)行細(xì)菌檢測。（ii）這種與微流體技術(shù)集成的SDwalker實(shí)現(xiàn)了高度可編程和可視化的條形碼編碼方法。（iii）顏色和強(qiáng)度編碼條形碼是通過調(diào)整染料的顏色和調(diào)節(jié)響應(yīng)目標(biāo)的SDwalkers種類的數(shù)量來構(gòu)建的，這克服了傳統(tǒng)顏色編碼方法的光譜重疊，并用理論編碼實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的超多重分析，細(xì)菌表型檢測和鑒定有20種不同的模式。此外，通過與商業(yè)FCM的整合，我們證明了這種方法的可行性，以及在實(shí)際樣品分析中的高特異性和識別準(zhǔn)確性。因此，設(shè)想該SDwalker-Drop在生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷中具有有希望的應(yīng)用。

Stochastic DNA Walker in Droplets for Super-Multiplex Bacteria Phenotype Detection

(Angew. Chem. Int. Ed., 2019, DOI: 10.1002/anie.201906438)

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