酶在細(xì)胞中具有高催化效率，但是在與細(xì)胞環(huán)境不相同的條件下，酶的壽命會縮短并且催化效率降低。解決這一問題的方法之一是設(shè)計(jì)一種仿生微環(huán)境來保護(hù)酶，從而使其功能可以保留在不利的環(huán)境中。由金屬離子和有機(jī)配體形成的金屬有機(jī)骨架（MOF）具有多孔結(jié)構(gòu)以及平衡的剛性和柔性，這類似于細(xì)胞環(huán)境。研究人員已開發(fā)出多種方法將天然酶封裝在MOF中構(gòu)建仿生微環(huán)境，從而改善酶在惡劣環(huán)境下的生理功能。其中，共沉淀和仿生礦化是在環(huán)境條件下將酶、金屬離子和有機(jī)配體在溶液中混合，以制備酶-MOF復(fù)合物。然而，共沉淀方法合成的酶-MOF復(fù)合物的活性與細(xì)胞環(huán)境中酶的活性相差甚遠(yuǎn)。為了提高酶的活性，迫切需要研究在共沉淀過程中酶、金屬離子和有機(jī)配體的作用機(jī)制。

圖1 基于微流體通道內(nèi)層流梯度混合產(chǎn)生的晶體缺陷效應(yīng)提高酶催化劑表觀活性示意圖。在微通道中，由于反應(yīng)物濃度梯度變化產(chǎn)生配位缺陷，生成含有介孔的酶-MOF復(fù)合物（A），而在常規(guī)溶液反應(yīng)下形成的酶-MOF復(fù)合物為微孔結(jié)構(gòu)（B）。

微流體技術(shù)以小規(guī)模（微米）處理流體，不僅實(shí)現(xiàn)了按比例定律可預(yù)測的效果，而且還實(shí)現(xiàn)了新的流體力學(xué)特性。這些特征允許在空間和時(shí)間上對液體進(jìn)行精確處理，以獲得在本體合成中不可能的混合條件。近期，香港浸會大學(xué)任康寧博士和清華大學(xué)戈鈞副教授合作提出了在微流體流中合成酶-MOF復(fù)合物，其中酶活性顯著提高。作者在微流體系統(tǒng)內(nèi)部使用了三元混合方案，實(shí)現(xiàn)了精確控制的擴(kuò)散混合條件，并允許一種成分在幾秒鐘后加入系統(tǒng)。微流體合成中MOF前體的濃度不斷變化，導(dǎo)致酶-MOF復(fù)合物出現(xiàn)結(jié)構(gòu)缺陷，從而提高了底物的親和性和酶活性。相關(guān)成果以“Defect-induced activity enhancement of enzyme-encapsulated metal-organic frameworks revealed in microfluidic gradient mixing synthesis”為題發(fā)表在Sci. Adv. 上（DOI: 10.1126/sciadv.aax5785）。

作者首先使用雙Y形微流體在微通道中合成酶-MOF復(fù)合物，鋅離子（Zn2+）、2-甲基咪唑（2-MeIM）和蛋白質(zhì)作為反應(yīng)物，第二個(gè)Y形微流體用于在前兩種反應(yīng)物混合后再添加另一種反應(yīng)物。反應(yīng)物之間的混合依賴于流體擴(kuò)散，由于雷諾系數(shù)低，這是一種可精確預(yù)測的合成方式。該方法可以通過時(shí)間間隔轉(zhuǎn)換來控制混合，計(jì)算微通道中的速度分布和濃度分布，反應(yīng)物經(jīng)過足夠的時(shí)間混合后再到達(dá)在第二個(gè)Y結(jié)處與蛋白質(zhì)分子混合。在該微通道中，作者以三種代表性的混合方式合成了細(xì)胞色素c（Cyt c）-MOF復(fù)合物，驗(yàn)證了蛋白質(zhì)-MOF復(fù)合物形成的可能機(jī)制，表明蛋白質(zhì)分子首先吸附2-MeIM，然后誘導(dǎo)蛋白質(zhì)周圍MOF骨架的仿生礦化。微流體制備的酶-MOF復(fù)合物的結(jié)晶度降低，XRD峰向低角度移動，這可能是由于復(fù)合材料中的缺陷所致。

為了研究微流體合成中的特殊混合方式是否會改變產(chǎn)物的性能，作者使用微流體流制備了葡萄糖氧化酶（GOx）-MOF復(fù)合物，其負(fù)載了8.45％的GOx，并顯示出98％的GOx活性，這是通過共沉淀過程制備的酶-MOF復(fù)合物的酶活性的最高記錄。為了驗(yàn)證酶-MOF復(fù)合物具有高活性是否是由于2-MeIM和Zn2+之間相對較高的摩爾比，作者通過調(diào)節(jié)2-MeIM和Zn2+的比率合成了GOx-MOF復(fù)合物。梯度混合誘導(dǎo)的酶-MOF復(fù)合物具有高催化活性，其中比率的連續(xù)變化是關(guān)鍵因素，而不是高比率。為了研究梯度混合法使酶-MOF復(fù)合物的活性顯著增加的根本原因，作者采用微流體流動合成和本體溶液合成制備了GOx-MOF復(fù)合物。通過傅立葉變換獲得了R空間信息研究微流體合成樣品與本體溶液合成的樣品中的Zn原子周圍的短程局部結(jié)構(gòu)，結(jié)果與鋅和N原子的配位相對應(yīng)的峰有良好的一致性，這表明Zn-N配位也存在于微流體合成MOF中。相比本體溶液合成MOF，微流體合成MOF中鋅原子具有較高的表觀配位數(shù)，揭示了在微流體合成的GOx-MOF復(fù)合物中，鋅原子出現(xiàn)在骨架中并與N原子相互作用導(dǎo)致了鋅原子配位缺陷。

微流體合成Cyt c-MOF復(fù)合物的、結(jié)構(gòu)、形貌等示意圖（來源：Sci. Adv.）

為了驗(yàn)證該方法的通用性，作者使用辣根過氧化物酶制備了HRP-MOF復(fù)合物。與天然HRP相比，HRP-MOF復(fù)合物中HRP負(fù)載量百分比為4.71％，并且具有約63％的活性。酶活性增強(qiáng)的原因可能是酶分子在MOF納米晶體的生長過程中被囊封，因此靠近顆粒表面，從而可以更好地接近底物分子。同時(shí)，微流體合成的酶-MOF復(fù)合物在高溫和蛋白酶消化下的穩(wěn)定性也優(yōu)于相應(yīng)的天然酶，并且作者還觀察到增強(qiáng)的可重復(fù)使用性和存儲穩(wěn)定性。微流體合成復(fù)合材料活性的提高主要?dú)w因于MOF中的缺陷，從而促進(jìn)了基質(zhì)的擴(kuò)散。與本體溶液合成相比，通過微流體合成制備的所有復(fù)合物均顯示出顯著增強(qiáng)的活性，但通過微流體以不同混合方案合成的復(fù)合物也顯示出活性差異，這可能是由于酶在MOF中的位置不同所致。當(dāng)使用微流體層流合成方法時(shí)，可以將缺陷的程度控制在合適的點(diǎn)。

微流體合成的酶-MOF復(fù)合物與單一酶活性的對比（來源：Sci. Adv.）

小結(jié)：香港浸會大學(xué)化學(xué)系任康寧博士和清華大學(xué)戈均副教授等人合作，通過微流體合成酶-MOF復(fù)合物，提高了酶的活性、穩(wěn)定性和耐久性。在沿著微通道的反應(yīng)物比率連續(xù)變化的情況下，所得產(chǎn)物顯示出配位缺陷，形成中孔微結(jié)構(gòu)。孔徑的多峰分布確保了酶的固定，降低了對傳質(zhì)的抵抗力。微流體層流合成策略獨(dú)特的梯度混合性質(zhì)，可控制、連續(xù)和快速地合成具有改進(jìn)活性的酶-MOF復(fù)合材料，這為酶-MOF復(fù)合材料和其他生物復(fù)合物的合成提供一種新的通用方法。